记录大鼠动脉压力变化引起的肾交感神经活动反应

摘要

来源：Fink, A. M.，等。在麻醉大鼠中量化中枢神经系统干预引起的肾交感神经活动的急性变化。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种研究大鼠动脉压力变化时肾交感神经（RSNs）活动的技术。首先将压力感应导管连接至股动脉，暴露肾交感神经。随后将神经提起并置于记录电极上，记录其电活动。接着注射血管收缩药物以升高血压，并监测肾交感神经活动的相应变化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 制备双极RSNA电极

1. 制备电极时，剪取两段长约18 mm的不锈钢丝。另剪取一段长约15 mm的聚乙烯（PE-50）管。将两根金属丝穿入管中，使金属丝两端均露出管外。
2. 剥离金属丝末端的绝缘层，修剪后保留2–3 mm的裸露金属丝。在一端，将公针压接在裸露的金属丝上。将针脚牢固地焊接到金属丝上，将针脚固定在连接器条内，并用环氧树脂覆盖连接处。
   注意：一种无需焊接的替代方法是使用快速连接/拆卸的鳄鱼夹。
3. 在电极的另一端，剥离金属丝末端的绝缘层，保留2–3 mm的裸露金属丝。将该部分金属丝弯折，形成小“V”形钩状结构。
   注意：此部分电极将与肾交感神经接触。必须对这一端进行密封，以防止液体进入管内。可有效使用硅胶或环氧树脂进行密封。

2. 给予麻醉并准备手术区域

1. 对一只雄性Sprague Dawley大鼠（年龄9-11周，体重150-400 g）实施麻醉。通过腹腔（IP）注射给予戊巴比妥钠50 mg/kg。为评估手术期间稳定的麻醉深度，每15分钟检查一次足趾夹捏反射，并根据需要追加麻醉剂量。
   注意：在先前的研究中使用戊巴比妥钠（Nembutal）实现持续的麻醉深度，且不干扰肾交感神经活动（RSNA）的调节。本方案适用于非存活手术，因此无需恢复期或术后监测。
2. 根据机构动物护理指南准备手术区域（即剃除大鼠腹部、背部和头部的毛发，用10%聚维酮碘溶液清洁皮肤，涂抹眼用润滑剂，并将大鼠置于加热垫上）。实验期间维持体温在37 °C。

3. 为监测平均动脉压进行股动脉插管

1. 在显微镜下观察动脉。与静脉插管方法类似，结扎远端缝线以阻断动脉；用丝带将该缝线的边缘固定在手术区域，并使动脉方向垂直于术者惯用手。
2. 若使用遥测技术进行动脉通路
   1. 在动脉插管前，于高倍放大镜下检查压力感应导管。确保导管内无气泡或碎屑，并且在液体填充（近端）与凝胶填充（远端）部分之间存在完整液面。每次植入前，应重新填充导管远端尖端的凝胶。使用磁铁开启发射器；在手术过程中监测血压（BP），以确保导管位置准确。
   2. 在近端缝线上打一个松散的单结半结，暂时阻断股动脉。用非惯用手持住导管导入器。使用血管插管镊夹持遥测装置的套管尖端，避免尖端处的凝胶被移位。
   3. 用弯曲的22G针头在动脉上穿刺一个小孔，然后使用血管插管镊将套管插入动脉，注意避免尖端凝胶移位。尽可能将套管向前推进。利用近端和远端缝线结扎，固定压力导管。
   4. 将遥测植入装置主体置于切口附近的侧腹部，并使用带切割针的4-0尼龙缝线关闭切口。在记录期结束后，用磁铁关闭遥测设备，以延长电池寿命。

4. 将大鼠置于立体定位手术架上以暴露脑部

1. 将大鼠轻柔地置于立体定位手术架上，使其呈俯卧位。
2. 将大鼠置于耳杆之间，并调节门齿杆，使后囟（lambda）与前囟（bregma）处于同一高度。定位可能因大鼠品系、体重以及中枢神经系统（CNS）靶点的位置而有所不同。
3. 使用手术刀沿头皮正中线做一条长约2 cm的前后向切口。用棉签牢固地清除颅骨表面的结缔组织。向颅骨表面滴加过氧化氢，以帮助清晰显示前囟、后囟及正中缝。
4. 参照大鼠脑图谱确定靶点位置，在颅骨上钻一个大小适合电极插入的环钻骨窗。

5. 分离肾交感神经

1. 将导线式肾交感神经活性（RSNA）电极（步骤 1.1–1.3）连接至10倍前置放大器和微电极放大器。
2. 在将大鼠固定于立体定位仪之前或之后，通过腹膜后切口分离肾神经。当大鼠已固定于立体定位仪后，放置RSNA电极。使用手术刀从肋缘下方4–5 cm处开始，沿尾侧方向做一皮肤切口，位置略偏于脊柱。钝性分离切口组织，以暴露椎旁肌。
3. 使用剪刀在脂肪与肌肉交界处做一浅表的、长约1–2 cm的头尾向切口。用棉签轻轻将脂肪组织从肌肉上推开，以暴露肾脏。注意切勿进入腹膜腔。
4. 使用牵开器轻柔地将肾脏与椎旁肌分离，以暴露肾动脉和腹主动脉。避免过度牵拉血管，以防损伤肾神经。使用一块2英寸×2英寸、浸有生理盐水的纱布垫保护肾脏，防止损伤。
5. 在高倍放大下，于切口腔隙中辨认肾神经。神经束最易在主动脉与肾动脉形成的直角区域观察到。肾神经紧随肾动脉，从主动脉延伸至肾脏。
6. 选择一段神经束用于放置在记录电极上。使用显微解剖镊子轻柔地将神经纤维从周围组织或血管中分离出来。
7. 将导线式RSNA电极固定于电极夹持器中（例如，连接在支撑架上的鳄鱼夹）。将电极下降至神经段水平。使用神经钩轻柔地将肾神经段提起并置于电极上，避免牵拉神经。
   注意：神经应位于裸露导线的两个“V”形钩内，且与神经走向平行。电极导线不得接触其他任何组织、血液或淋巴液。
8. 用矿物油填充切口，防止暴露的肾交感神经干燥。使用接地夹，一端连接切口处皮肤，另一端连接法拉第笼。
9. 通过高通和低通滤波器（10 Hz 和 3 kHz）将信号导入放大器。增益可调节至10 K。配备音频监测器以评估RSNA的脉冲放电模式。采样率设置在2,000–10,000 Hz之间。当假设中枢神经系统操作可能引起快速或短暂的交感反应时，应采用更高的采样率。

6. 记录数据

1. 通过静脉注射 1 mL 生理盐水或 10 µg/mL 去氧肾上腺素（0.1 mL）诱发压力感受性反射，以评估肾交感神经活动（RSNA）记录的质量。如图 1所示，输注应引起血压（BP）升高并抑制 RSNA。平均动脉压升高 60–80 mmHg 即足以实现肾交感神经抑制。
2. 如有必要，调整电极位置以改善信号质量。若神经未同时接触电极的两个钩状电极，或有组织、血液或淋巴液接触导线，则需重新定位。
   注意：是否需要重新定位取决于神经放电的听觉特征。
3. 获得清晰信号后，通过吸除矿物油并在切口腔内用硅胶覆盖神经与电极连接处，固定 RSNA 电极。在硅胶完全固化前，切勿移动大鼠。
4. 在持续记录 RSNA 和平均动脉压的同时，实施中枢神经系统（CNS）干预方案。若使用微注射仪/脉冲发生器进行脑干干预，可将该设备的逻辑信号输入 RSNA/BP 记录系统，以标记 CNS 干预的时间点。
5. 实验结束后，通过在硅胶与脊髓肌肉之间压碎记录电极近端的神经来测定噪声水平。记录至少 30 秒的 RSNA “零值”信号。作为量化噪声的替代方法，可给予短效神经节阻断剂，如阿托品、六甲溴铵、氯甲碘铵或戊双吡铵酒石酸盐。
6. 小心移除 RSNA 电极，并清除导线电极上残留的硅胶痕迹。保存电极以供重复使用。关闭遥测发射器并小心取出，注意避免损坏导管尖端。

结果

图1：静脉注射去氧肾上腺素后肾交感神经活动（RSNA）和血压（BP）的变化。 原始RSNA（A）经全波整流处理（B）；插图C显示整流后压碎的“零”RSNA。计算了非重叠的10秒平均值（减去噪声）（D）。为诱发压力感受性反射，于箭头处静脉注射0.1 mL去氧肾上腺素（1 µg/mL）。推注给药引起血压急剧升高，并短暂抑制RSNA。脚桥被盖核调控戊巴比妥麻醉大鼠的肾交感神经活动及心呼吸活动

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不锈钢丝	A-M Systems; Sequim, WA	791000	RSNA电极
聚乙烯（PE-50）导管	VWR; Radnor, PA	63019-048	RSNA电极；血管插管
微型针式连接器	A-M Systems; Sequim, WA	520200	RSNA电极
压接工具	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL	M22520	RSNA电极
连接器条带	Amphenol; Clinton Township, MI	221-2653	RSNA电极
J-B Kwik 环氧树脂胶	J-B Weld, Sulphur Springs, TX	8270	RSNA电极
硅胶	Permatex; Hartford, CT	2222	RSNA电极
肝素钠注射液（10 mL 小瓶，1000 U/mL）	KV Veterinary Supply; David City, NE	P03466	静脉通路通畅性维持
盐酸去氧肾上腺素注射液（1 mL 小瓶，10 mg/mL）	ACE Surgical Supply; Brockton, MA	950-6312	检测肾交感神经抑制
单钩弹性外科固定夹	Harvard Apparatus; Holliston, MA	72-2595	切口
丝质外科胶带	3M, Minneapolis, MN	1538-0	固定外科固定夹
20 G 针头	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	Z192554-100EA	血管插管
Dumont #7 弯头镊	Fine Science Tools; Foster City, CA	11274-20	血管插管
5-0 丝线结扎线	Braintree Scientific; Braintree, MA	SUT-S 106	血管插管
精细止血钳	Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-7117	血管插管和RSNA手术
Crile 止血钳	Fine Science Tools; Foster City, CA	13004-14	针头弯曲
遥测发射器	Data Sciences International; Minneapolis, MN	PA-10	平均动脉压监测（遥测）
Re-gel 注射器	Data Sciences International; Minneapolis, MN	276-0038-001	遥测发射器重复使用（遥测）
一次性压力换能器	Transpac; San Clemente, CA	MI-1224	平均动脉压监测
Clear-Cuff 压力输注器	MILA International Inc.; Florence, KY	2281339	平均动脉压监测
血管插管镊	Fine Science Tools; Foster City, CA	00574-11	导管插入
黑色单丝尼龙4-0缝线，带反向切割针	McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA	S661GX	固定遥测发射器
遥测接收器	Data Sciences International; Minneapolis, MN	RPC-1	平均动脉压监测（遥测）
LabChart Pro（软件），PowerLab（数据采集硬件）	AD Instruments; Colorado Springs, CO	ML846, MX2 matrix 2.0（兼容Data Science International遥测系统）	软件/数据采集硬件的3种选择
SciWorks（软件），DataWave（数据采集硬件）	DataWave Technologies, Loveland, CO	N/A
Spike 2（软件），Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., London UK	1401-3
微型钻	Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-6300	中枢神经系统手术
立体定位手术架	Stoelting; Wood Dale, IL	51600	中枢神经系统手术
带10X前置放大器的微电极放大器	A-M Systems; Sequim, WA	1800-2	RSNA记录
牵开器	Fine Science Tools; Foster City, CA	17009-07	RSNA记录
显微解剖镊	Fine Science Tools; Foster City, CA	11251-10	RSNA记录
微型钩	Fine Science Tools; Foster City, CA	10064-14	RSNA记录
矿物油	Fisher Scientific; Waltham, MA	8042-47-5	RSNA记录
音频监测器	A-M Systems; Sequim, WA	3300	RSNA记录
硅胶	Wacker, Munchen; Germany	RT601A-B	RSNA记录
电夹	Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland	EB0283-000	接地或固定灌注针
Bonn 剪刀，直头/锐头	Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD	RS-5840	灌注
灌胃针	Harvard Apparatus; Holliston, MA	75-0286	灌注
Masterflex 灌注泵	Cole-Parmer; Vernon Hills, IL	7524-10	灌注
Masterflex 铂金固化硅胶管	Cole-Parmer; Vernon Hills, IL	96410-15	灌注
甲醛（10% 缓冲溶液，4 L）	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	HT501128	灌注
蔗糖	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	S0389	抗冻保护