小鼠脑切片中重编程神经元的电生理记录

摘要

来源：Pereira, M.，等。通过脑内注射病毒载体在体内直接将原位胶质细胞重编程为中间神经元。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种在转染小鼠纹状体脑片中评估胶质细胞向神经元成熟与重编程的实验方案。该实验利用神经元特异性荧光标记物和电生理技术，检测静息膜电位以及对电流注入的反应。在这些测量过程中出现的电压尖峰，表明神经元的成熟与重编程已成功实现。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 全细胞膜片钳记录

1. 将第一块组织切片转移至充满持续流动 Krebs 溶液的记录 chamber 中。使用轻质重物固定切片，并将物镜浸入溶液中。
2. 在显微镜下识别纹状体区域，并寻找表达GFP（重编程）的神经元。选择形态广泛且未被纤维束或血管覆盖的神经元。
3. 准备用于膜片钳的硼硅酸盐玻璃移液管（3–7 MΩ），并充入以下细胞内溶液（单位：mM）：122.5 葡萄糖酸钾，12.5 KCl，0.2 EGTA，10 HEPES，2 MgATP，0.3 NaGTP₃GTP 和 8 NaCl，用 KOH 调至 pH 7.3。
4. 将玻璃移液管连接至记录电极，并浸入溶液中。仔细检查电极的电阻。然后缓慢移动移液管接近细胞，同时在电极上保持轻微的正压，以防止尖端堵塞。
   警告： 下降电极时需小心追踪细胞位置，避免细胞荧光发生漂白（即在不需要时关闭荧光灯）。
5. 用移液电极的正向压力小心冲洗周围组织，并将电极靠近细胞。将电极准确定位于细胞正上方，缓慢下降直至电极接触细胞膜。在电极与细胞膜之间形成吉欧（Giga-Ω）封接，随后施加负压脉冲，破裂膜片以形成全细胞记录模式。
   警告： 重编程的神经元较为敏感。在进行膜片钳操作时需格外小心，当形成吉欧姆（Giga-Ω）封接或破膜时，避免施加过强的负压。此外，对较年老动物进行膜片钳操作需要更多练习与耐心，因其结缔组织较厚，神经元更难观察。
6. 在电流钳模式下破膜后，立即检测静息膜电位，并记录下来用于分析。
7. 在电流钳模式下，将细胞膜电位维持在 -60 mV 至 -80 mV 范围内，并注入持续时间为 500 ms、范围从 -20 pA 到 +90 pA、以 10 pA 为增量的电流，以诱发动作电位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaH2PO4-H2O	Sigma-Aldrich	S9638
MgCl2-6 H2O	Sigma-Aldrich	M2670
CaCl2-6 H2O	Sigma-Aldrich	C8106
MgSO4-7 H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
K-D-葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	G4500 Sigma
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KOH-EGTA（乙二醇双-N-四乙酸）	Sigma-Aldrich	E3889 Sigma
KOH-Hepes 酸（N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）	Sigma-Aldrich	H7523
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Mg2ATP	Sigma-Aldrich	A9187
Na3GTP	Sigma-Aldrich	G8877
冰
硼硅酸盐玻璃移液管	Sutter 公司	B150-86-10
玻璃毛细管拉制仪	Sutter 公司	P-1000
水浴锅	Thermo Fisher Scientific	TSGP02
Clampfit 软件	Molecular Devices