在转基因小鼠脑内植入光学窗口以成像神经活动

摘要

来源：Lin, X.，等。利用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了通过转基因小鼠颅骨上的光学窗口记录大脑神经活动的过程。这些小鼠表达一种荧光蛋白，可用于检测神经活动。通过小心移除一小部分颅骨以安装光学窗口，随后用黑色水泥覆盖颅骨，以在成像前阻断光线。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 准备用于成像的动物

1. 将无菌纱布、棉签和已高压灭菌的外科手术器械放置于手术区域。开启微型珠灭菌器，用于手术过程中手术器械的间歇性灭菌。
2. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠（雄性或雌性，1.5–2.5 月龄，20–25 g）混合麻醉剂（氯胺酮 17.2 mg/mL、赛拉嗪 0.475 mg/mL 和乙酰丙嗪 0.238 mg/mL），剂量为 6 µL/g 体重，进行麻醉。待动物对脚趾夹捏刺激无反应且角膜反射消失时，表明已达到适宜的麻醉深度。手术过程中，根据需要给予初始剂量 1/3 的追加麻醉剂，以维持原有的麻醉状态。
3. 术前皮下注射（s.c.）布托啡诺（0.05–0.10 mg/kg）作为镇痛剂。在动物眼部涂抹保护性眼膏，以防止角膜干燥和白内障形成。
4. 将 GCaMP6s 转基因小鼠置于加热垫上，防止低体温，并用无菌手术巾覆盖。使用小鼠头部固定适配器稳定动物头部。
5. 使用双面剃须刀片剃除大部分头皮区域的毛发。先用无菌酒精棉片清洁手术区域，再使用聚维酮碘溶液进行消毒。

2. 慢性颅窗制备

1. 用剪刀在颅骨的一侧（右侧）剪出一个矩形切口（2 mm × 3 mm）。用棉签将皮肤拨开，形成一个直径 >3 mm 的暴露区域（图1A）。用钝头显微外科刀片（手术刀片#10）轻轻刮除附着在颅骨上的结缔组织（图1C）。
2. 使用牙科钻头在颅骨上轻轻画一个圆圈（直径3 mm，中心坐标：从前囟向后1.5 mm，距中线2.5 mm），标记S1区域（图2B）。
3. 在左侧颅骨上重复相同操作（图2B）。
4. 在骨面上涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯超级胶水，为后续涂抹牙科水泥提供基底。
5. 在解剖显微镜下，使用高速微型钻头在S1区域周围颅骨上磨出一个环形凹槽（图1D），目的是形成一个平滑的边缘，以便放置光学窗口。
6. 在减薄过程中，定期反复滴加人工脑脊液（ACSF，室温），以助于钻孔并散热。间歇性进行钻孔，避免因摩擦导致过热。使用实验室真空管线或真空泵吸除骨屑。
7. 当钻至骨层约2/3深度时，缓慢而小心地继续减薄剩余1/3的骨层，直至圆形骨片（骨瓣）完全与周围颅骨分离。
8. 用#5/45镊子缓慢而小心地取出圆形骨瓣，暴露硬脑膜（图2C；图1E）。
9. 用ACSF保持暴露脑区湿润（图1E）。避免损伤软脑膜血管，因为出血会改变脑血流，加速脑肿胀，并严重降低成像质量。
10. 在颅骨左侧（对侧）重复相同操作。
11. 组装光学窗口时，使用光学粘合剂逐层粘合盖玻片并固化。如有必要，将光学窗口置于培养箱中加热（50 °C，12 h）以增强粘合强度。光学窗口包含两部分：上部为单层圆形盖玻片，直径5 mm；下部为1–3层圆形盖玻片，直径3 mm（图2D）。
12. 将光学窗口保存于乙醇（70%，体积比）中，使用前用无菌生理盐水冲洗。在安装光学窗口前，需在体视显微镜下检查其是否存在缺陷，例如光学粘合剂用量不当或对位不准。
13. 将光学窗口安装在颅骨开窗区域上方（图2D）。光学窗口的上部置于颅骨表面，下部嵌入开颅孔内，并在脑脊液存在下贴合于硬脑膜上（图2D, E）。
14. 用氰基丙烯酸酯超级胶水将光学窗口上部边缘密封固定于颅骨上（图2F；图1F）。
15. 待氰基丙烯酸酯超级胶水干燥后，用黑色牙科水泥（Dentsply）覆盖玻璃边缘。将牙科水泥涂抹至所有暴露的颅骨及伤口边缘，以屏蔽光线（图2G-H；图1B）。
16. 在左侧重复相同操作。
17. 将动物置于加热垫上恢复，并在适当监测下送回饲养笼中。提供湿粮以促进咀嚼和补水。为减轻疼痛，受伤后每8–12小时皮下注射一次布托啡诺（0.05–2.0 mg/kg），持续2天。成像前再让小鼠恢复7–10天。

结果

图1. 颅骨双侧窗口的制备。（A）照片显示在颅骨两侧S1区域上方各有一个颅骨光学窗口。（B）图像（A）中框选区域的高倍放大图，显示双侧光学窗口暴露了下方的硬脑膜和血管。比例尺 = 680 µm。（C）暴露的颅骨。（D）在颅骨上制作一个环形凹槽，其中可见中央骨瓣。比例尺 = 900 µm。（E）去除骨瓣后，颅骨开孔处填充人工脑脊液（ACSF）。比例尺 = 720 µm。（F）在颅骨开孔上安装光学窗口，并用超级胶水密封窗口边缘。通过光学窗口可清晰观察到硬脑膜和血管。比例尺 = 600 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	可以是任何通过遗传编码的神经元指示剂和效应器在皮层兴奋性神经元亚群中表达绿色荧光钙指示剂 GCaMP 的小鼠品系。
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	可以是任何在皮层特定神经元群体中表达 EGFP 的小鼠品系；可提供明亮的、类似高尔基染色的活体标记效果。
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	可选用任意品牌的同类产品。
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	可选用任意品牌的同类产品。
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	可选用任意品牌的同类产品。
Harishige's SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	可选用任意品牌的同类产品。
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	可选用任意品牌的同类产品。
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	可选用任意品牌的同类产品。
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	可选用任意品牌的同类产品。
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	可选用任意品牌的同类产品。
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	可选用任意品牌的同类产品。
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	可选用任意品牌的同类产品。
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	可选用任意品牌的同类产品。将5份白色牙科水泥粉（Grip Cement）与1份黑色水彩颜料粉（用于避光；部分使用者偏好10:1的比例）混合使用。
Gel foam	Moore Medical	2928	可选用任意品牌的同类产品。
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	可选用任意品牌的同类产品。
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	人工脑脊液（ACSF）包含 125 mM NaCl、4.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、1.25 mM NaH₂PO₄、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂ 和 20 mM 葡萄糖。用氧气（95% 氧气，5% 二氧化碳）持续通气，并将 pH 值调节至 7.4。每次实验前需新鲜配制 ACSF 溶液。