在大鼠中进行阴茎海绵体神经刺激以测量海绵体内压

摘要

来源：Hox, M.，等。大鼠阴部海绵体神经刺激及海绵体内压力记录。视频实验杂志 (2018)。

本视频演示了在麻醉大鼠中分离并刺激阴部海绵体神经，以研究海绵体内的血压变化。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术操作所需导管、电极及器械的准备

1. 使用以下显微外科器械：手术剪、弯头显微剪、组织镊、一对Dumont #7和#5弯头显微镊、显微持针器以及牵开器。
   注意：本操作为急性实验，因此器械无需灭菌。使用后用70%乙醇清洁并擦拭尖端。
2. 将导管浸泡在70%乙醇中，然后在使用前用含100 U/mL肝素的无菌0.9% NaCl冲洗。保持导管充满液体，以避免向系统中引入气泡。
3. 截取一段20–30 cm长的聚乙烯（PE）-50导管，用于测量阴茎海绵体内压（ICP）。应确保导管尽可能短，以减少压力衰减。
4. 将一支无菌24G针头左右反复弯折，直至其中部断裂。将带有斜面的一端连接至PE导管远端，用于插入阴茎脚；另一段插入针座，用于连接压力传感器。用肝素化生理盐水（100 U/mL）充满整个系统。
5. 制作双极聚四氟乙烯（Teflon）涂层电极时，将两根125 μm银丝剪成等长。用胶带将银丝固定在桌边并使其并列排列，然后将电极固定在黑色板上。
6. 在聚四氟乙烯涂层上做一小切口，使用#5显微镊剥离电极尖端4–5 mm长度的涂层。用手术刀切齐尖端以保证长度一致，并将末端围绕手术刀钝边弯曲形成钩状。
7. 将电极用胶带固定在黑色板上，使其末端略微伸出板缘，且钩端朝上。在塑料板上混合硅胶胶水10秒，并在距钩部1–2 mm处包裹一个胶泡。
8. 静置干燥约5分钟后即可使用（图1）。在另一端较长的一段上剥离聚四氟乙烯涂层，以便连接刺激器。
   注意：若需重新制作远端的钩部，该电极可多次重复使用。

2. 动物准备

1. 麻醉动物后，剃除腹部下半部、颈部和会阴部的毛发。用70%酒精擦拭动物，随后用聚维酮碘擦拭，重复三次。将大鼠仰卧位放置在加热的手术垫上。涂抹兽用眼膏，并将麻醉方式切换至鼻罩，使用2.5%异氟烷和0.8 L/min氧气作为载气。
   注意：调整异氟烷和氧气的浓度，以达到适当的麻醉水平。

3. 术前准备

1. 整个手术过程均需在手术显微镜下进行：3.15X 至 20X 的放大倍数已足够。手术过程中应佩戴手套，并始终保持无菌环境。将大鼠置于手术巾上。

4. 用于ICP测量的坐骨海绵体肌分离术

1. 使用手术刀、直剪刀和Dumont #7弯显微镊，在阴茎基底部水平处开始，沿中线外侧5 mm处向下做一条1 cm长的垂直皮肤切口（图2A）。用棉签仔细分离阴囊外侧的筋膜（图2B）。解剖筋膜后，安装牵开器，并用棉签触诊以定位坐骨结节（图2C）。
2. 从此点向内侧解剖脂肪组织，直至观察到坐骨海绵体肌（图3A）。使用一对Dumont #7弯显微镊纵向分离该肌肉。白膜呈现为亮白色结构（图3B）。利用显微镊和显微剪充分暴露白膜，以观察其走行路径（图3C）。
3. 在系统参数校准后，将导管经会阴部皮肤插入，确保其与阴茎脚平行（图4）。保持导管位置不变，并用生理盐水保持切口湿润。

5. 刺激用喉上神经解剖

1. 使用手术刀先做一条2 cm长的下腹部正中皮肤切口，然后使用直剪刀和显微镊完成切口。沿腹白线在筋膜及下方肌肉组织上做相应的切口，以暴露膀胱和前列腺。
2. 使用牵开器以获得良好术野。用棉签将前列腺从脂肪组织中分离，清晰显露位于前列腺背外侧的主要盆腔神经节（MPG）和海绵体神经（CN）（图5）。
3. 在显微镜下确认MPG和CN后，使用角度显微剪刀在MPG远端2-5 mm处切开覆盖在神经上的筋膜（图6a）。使用#5显微镊将神经两侧及下方的组织轻轻分离，游离出约4 mm长的一段神经（图6b），并将一根9-0缝线从神经下方穿过（图6c）。
4. 借助缝线轻轻提起神经（图7a），以便将双极电极的钩子放置于神经周围（图7b）。让助手用胰岛素针头尖端将双组分硅胶胶水混合5秒。将神经擦干，并在电极钩周围及神经周围涂抹胶水（图7c, d）。轻轻牵拉电极，保持神经抬高状态约1分钟，使胶水充分干燥。
5. 除右侧的牵开器外，移除其余牵开器，以避免对电极造成牵拉或扭转。用生理盐水润湿暴露的器官，并在切口处覆盖浸有生理盐水的纱布。

6. 用于 ICP 测量的海绵体插管

1. 使用拉钩恢复白膜的可视化。注意不要将拉钩固定在坐骨海绵体肌上，以免扭曲阴茎脚。
2. 连接针头，并在将其插入白膜前用肝素化生理盐水冲洗导管。用非优势手使用Dumont #7弯头显微镊子夹住插入点远端的白膜及覆盖其上的其余肌肉组织，保持白膜处于拉伸状态；另一只优势手用直头显微镊夹持针头，沿阴茎海绵体走行方向平行插入针头（图8）。
3. 将针头推进至海绵体内部5-8 mm处。冲洗导管，并按压阴茎脚以测试导管通畅性（图9），确认无渗漏。用胶带将导管固定于实验台，防止导管意外牵拉。移除拉钩。

7. 刺激 CN

1. 运行记录程序（例如 Spike 2）时，持续记录阴茎海绵体内压和平均动脉压。
2. 设置刺激器（例如 SD9 Grass Instruments，参见材料表）的以下参数以刺激阴茎神经（CN）：电流 1.5 mA，频率 16 Hz，电压 3 V，脉冲宽度 5 ms。每次刺激持续 50 秒，两次刺激之间至少休息 1 分钟。
   注意：首次刺激通常会产生较弱的反应（图 10）。

结果

图1. 双极特氟龙包被银电极。（A）包被区与未包被区交界处的胶泡。（B）电极远端2 cm处紧密编织。（C）间距为1 mm的平行未包被钩状结构。

图2. 海绵体解剖——解剖标志。（A）从阴茎基底部外侧2 mm处开...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adson 镊子	Fine Science Tool	11006-12
Dumont #7 镊子	Fine Science Tool	11271-30
Dumont #5 镊子	Fine Science Tool	11273-20
ToughCut Mayo 剪刀	Fine Science Tool	14110-15
微型 Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tool	15006-09
超细止血钳	Fine Science Tool	13020-12
Crile 止血钳	Fine Science Tool	13004-14
Kwik-Sil 粘合剂	World Precision Instruments	KWIK-SIL
特氟龙涂层银丝 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0510
弹性导线牵开器	定制
手术刀片	Fine Science Tool	10023-00
PE-50 导管	Warner Instruments	64-0753
23 G 针头	Kruuse	121272
SD-9 方波刺激器	Somatco	1077/183
血压换能器及连接线	World Precision Instruments	BLPR2
Raucotupf 棉签	Lohmann-Raucher	11966
Pro-ophta 眼科棉签	Lohmann-Raucher	16515
0.9% 氯化钠溶液 100 mL	本地药房
肝素	本地药房
25 mL 注射器	欧登塞大学医院
兽用眼膏 - Viscotears	本地药房
银丝	Science Products GmbH, Heidelberg, Germany
硅胶粘合剂	Kwik-Sil, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA