脊髓切片中胶状质神经元的全细胞膜片钳记录

摘要

来源：Zhu, M., 等. 制备急性脊髓切片用于胶状质神经元的全细胞膜片钳记录。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了使用全细胞膜片钳技术对脊髓切片中胶状质（substantia gelatinosa, SG）神经元进行电生理记录的操作步骤，以分析神经元的放电模式。该方法可用于研究脊髓胶状质神经元对刺激的神经反应。

方案

所有涉及动物样本的操作均经过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 溶液与材料的准备

1. 溶液​
   1. 配制人工脑脊液（ACSF）（单位：mM）：117 氯化钠（NaCl），3.6 氯化钾（KCl），1.2 磷酸二氢钠二水合物（NaH₂PO₄·2H₂O）₂PO₄·2H₂O)，2.5 二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O)，1.2 六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O)，25 碳酸氢钠（NaHCO₃）₃），11 D-葡萄糖，0.4 抗坏血酸，和 2 丙酮酸钠。参见 表1.
   2. 制备 K⁺基于 mM 的细胞内溶液：130 K-葡萄糖酸盐，5 KCl，10 Na₂-磷酸肌酸, 0.5 乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸 (EGTA), 10 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES), 4 镁腺苷三磷酸 (Mg-ATP) 和 0.3 锂鸟苷三磷酸 (Li-GTP)。参见 表 2.
   3. 制备铯（Cs⁺)-为基础的细胞内溶液（单位：mM）：92 酰基甲烷磺酸铯（CsMeSO₃）₄），43 氯化铯（CsCl），10 钠₂-磷酸肌酸、5 四乙基氯化铵（TEA-Cl）、0.5 EGTA、10 HEPES、4 Mg-ATP 和 0.3 Li-GTP。参见 表3.
      注意： 所有溶液均须使用蒸馏水配制。ACSF 和蔗糖-ACSF 应通入碳合气体（95% O₂ 和 5% CO₂）饱和。₂ 和5% CO₂₂ 混合液）以维持约7.4的最适pH，且这两种溶液的渗透压应调整至300–310毫渗透摩尔（mOsm）。由于抗坏血酸可能影响钙通道，若需记录钙电流，则必须省略该试剂。细胞内溶液的渗透压和pH应分别测定并调整至290–300 mOsm和7.2–7.3。建议使用0.2 µm滤器过滤细胞内溶液，并将溶液分装为1 mL等分试样，于-20 °C保存。Cs⁺ 和TEA在Cs中应用⁺基于细胞内液阻断钾通道，有利于在记录抑制性突触后电流（IPSCs）时使用放大器将膜电位稳定在0 mV。
2. 仪器
   1. 对于典型的电生理系统，应使用配备红外微分干涉差（IR-DIC）和高分辨率水浸物镜的直立显微镜、CCD/CMOS相机、膜片钳放大器、微电极夹持器以及可精细调节电极位置的显微操作器。此外，还需要配备XY移动载物台以移动显微镜。
   2. 将所有设备安装在由法拉第笼包围的防震台上。将视频监视器连接到视频摄像机，以观察神经元并可视化微电极。
3. 微量移液器
   1. 使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管制成记录电极。当灌注细胞内液时，电极的典型阻抗范围为 3–6 MΩ。

2. 全细胞膜片钳记录

1. 为对胶状质（SG）神经元进行全细胞膜片钳记录，大多数记录情况下使用基于 K⁺ 的细胞内液，仅在记录抑制性突触后电流时使用基于 Cs⁺ 的细胞内液。
2. 将脊髓切片轻柔地移至记录浴槽中，并用尼龙线固定于U形铂丝上以确保切片稳定；通过重力灌流系统在室温（RT）下持续灌注通有混合气体的ACSF，灌流速度设定为2–4 mL/min，以实现充分氧合。
3. 使用低倍显微镜物镜识别胶状质区域（一条半透明带），再用高倍物镜选择一个形态健康的神经元作为目标细胞，并将其调整至视频监视器屏幕中央。
4. 根据需要，用适量的基于 K⁺ 或基于 Cs⁺ 的细胞内液填充玻璃微电极，将微电极插入电极夹持器中，并确保细胞内液与夹持器内的银丝良好接触。
5. 调节微电极至视野清晰，使用显微操作器将其浸入ACSF中，随后施加轻微正压（使用压力计测量约为1 psi），以防止微电极尖端被杂质堵塞。
6. 逐步将微电极移向目标神经元；当电极接近神经元时，释放正压，此时神经元膜上会形成微小凹陷，进而形成吉欧封接（gigaseal）。
7. 将钳制电位调整至-70 mV，该值接近细胞的生理静息膜电位（RMP）；随后对微电极施加短暂而轻柔的负压，以击穿膜片，形成良好的全细胞记录构型。
   注意：将切片转移至记录浴槽后，应确保至少5分钟的稳定灌流，以清除切片表面的碎片。值得注意的是，准确区分健康与不健康/死亡神经元对实现良好封接和稳定记录至关重要。不健康或死亡的神经元通常表现为肿胀或皱缩，并可见明显的大型细胞核；而健康的神经元则具有三维（3D）结构，细胞膜明亮且光滑，细胞核不可见。为获得理想的全细胞构型，必要时需逐步补偿快速或慢速电容。在室温（RT）条件下，基于 K⁺ 和基于 Cs⁺ 的细胞内液的液接电位分别计算为15.1–15.2毫伏（mV）和4.3–4.4 mV。在本研究中，所记录的数据未对液接电位进行校正。
8. 内在膜特性的记录
   1. 记录放电特性：在电流钳模式下，于静息膜电位（RMP）处施加一系列持续1秒的去极化电流脉冲（25–150皮安（pA），步长25 pA），检测每个神经元的放电模式；离线测量单个动作电位的阈值、幅度和半宽。

表1：人工脑脊液（ACSF）配方

组分	分子量	浓度 (mM)	g/L
NaCl	58.5	117	6.84
KCl	74.5	3.6	0.27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0.19
CaCl2·2H2O	147	2.5	0.37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0.24
NaHCO3	84	25	2.1
D-Glucose	180	11	1.98
Ascorbic acid	198.11	0.4	0.08
Sodium pyruvate	110	2	0.22

表2：基于K⁺的细胞内溶液配方

组分	分子量	浓度 (mM)	mg/100 mL
K-gluconate	234.2	130	3044.6
KCl	74.5	5	37.28
Na2-Phosphocreatine	453.38	10	453.38
EGTA	380.35	0.5	19.02
HEPES	238.31	10	238.3
Mg-ATP	507.18	4	202.9
Li-GTP	523.18	0.3	15.7

表3：基于Cs⁺的细胞内溶液配方

组分	分子量	浓度 (mM)	mg/100 mL
CsMeSO4	228	92	2097.6
CsCl	168.36	43	723.95
Na2-Phosphocreatine	453.38	10	453.38
TEA-Cl	165.71	5	82.86
EGTA	380.35	0.5	19.02
HEPES	238.31	10	238.3
Mg-ATP	507.18	4	202.9
Li-GTP	523.18	0.3	15.7

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma	S7653	用于制备人工脑脊液（ACSF）和磷酸盐缓冲液（PBS）
KCl	Sigma	60130	用于制备人工脑脊液（ACSF）、蔗糖-ACSF 和基于钾离子的细胞内溶液
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	用于制备人工脑脊液（ACSF）、蔗糖-ACSF 和磷酸盐缓冲液（PBS）
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	用于制备人工脑脊液（ACSF）和蔗糖-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	用于制备人工脑脊液（ACSF）和蔗糖-ACSF
NaHCO3	Sigma	S5761	用于制备人工脑脊液（ACSF）和蔗糖-ACSF
D-葡萄糖	Sigma	G7021	用于制备人工脑脊液（ACSF）
抗坏血酸	Sigma	P5280	用于制备人工脑脊液（ACSF）和蔗糖-ACSF
丙酮酸钠	Sigma	A7631	用于制备人工脑脊液（ACSF）和蔗糖-ACSF
蔗糖	Sigma	S7903	用于制备蔗糖-ACSF
K-葡萄糖酸盐	Wako	169-11835	用于制备基于钾离子的细胞内溶液
Na2-磷酸肌酸	Sigma	P1937	用于制备细胞内溶液
EGTA	Sigma	E3889	用于制备细胞内溶液
HEPES	Sigma	H4034	用于制备细胞内溶液
Mg-ATP	Sigma	A9187	用于制备细胞内溶液
Li-GTP	Sigma	G5884	用于制备细胞内溶液
CsMeSO4	Sigma	C1426	用于制备基于铯离子的细胞内溶液
CsCl	Sigma	C3011	用于制备基于铯离子的细胞内溶液
TEA-Cl	Sigma	T2265	用于制备基于铯离子的细胞内溶液
Na2HPO4	恒兴化学试剂		用于制备磷酸盐缓冲液（PBS）
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW150F-4	外径 1.5 mm，内径 1.12 mm
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-97	用于制备微电极
红外 CCD 相机	Dage-MIT	IR-1000
膜片钳放大器	HEKA	EPC-10
显微操作器	Sutter Instrument	MP-285
X-Y 位移台	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
直立显微镜	Olympus	BX51WI
渗透压仪	Advanced	FISKE 210
pH 计	Mettler Toledo	FE20