使用多通道线性硅探针记录行为小鼠的脑电活动

摘要

来源：Sauer, J., 等 在行为小鼠海马中记录空间限制性振荡。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种将多叉线性硅探针植入小鼠脑内以记录局部场电位的实验方案。该操作包括将探针固定于立体定位仪上，精确定位至目标脑区，将探针插入脑组织，并使用牙科水泥固定。植入完成后，用保护外壳覆盖整个装置。动物恢复后，该装置可用于记录局部场电位，从而揭示神经元活动特征。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备工作

1. 设计并制作一种合适的植入工具，在植入过程中临时携带硅探针和电极连接器。示例定制的植入工具参见图1。
2. 使用陶瓷尖头镊子小心地将硅探针和电极连接器从包装中取出。
3. 抬起连接器板，并使用固定在支架上的鳄鱼夹将其牢固固定。
4. 在体视显微镜下，使用陶瓷尖头镊子将探针与植入工具对齐。用灼烧器熔化石蜡，涂抹约2 mm厚的石蜡层，将探针粘附在植入工具上。操作过程中注意不要触碰探针的针柄部分。
5. 使用普通胶带将电极连接器固定在植入工具的杆部。请注意，根据制造商的不同，接地导线可能需要在植入前焊接到电极连接器板上。使用电烙铁（400 °C）加热焊锡，去除两段漆包铜线的绝缘层，并将接地导线焊接到电极连接器板的相应插槽中。
6. 去除另外两段铜线的绝缘层。将每根裸露的铜线在不锈钢螺钉（直径1 mm，长度2 mm）上缠绕三圈。使用适用于焊接钢的助焊剂，将铜线焊接到螺钉帽的底部。确保螺纹的下半部分不沾焊锡。
7. 使用标准万用表检测导线与螺钉之间的电接触是否良好。
8. 将硅探针的针柄部分和接地螺钉浸入70%乙醇中（10秒）进行消毒。
9. 通过将塑料巴斯德移液管的头部切半，为探针植入制作一个保护罩。

2. 植入手术

1. 使用热珠灭菌器对手术器械（剪刀、尖头镊子、手术钳）进行灭菌。用70%乙醇擦拭所有表面。
2. 使用约1 L/min的氧气输送3%异氟烷诱导麻醉。
   1. 维持麻醉时，使用 1 - 1.5% 异氟烷。请注意，不同动物达到手术耐受所需的异氟烷浓度可能有所差异。
   2. 当动物对脚趾夹捏无反应时，即达到稳定的外科麻醉状态。监测小鼠的呼吸频率，必要时调整异氟烷浓度。
   3. 将药膏涂抹于动物眼部，以防干燥。
3. 将小鼠固定于立体定位仪上，轻轻将耳杆插入耳道。当耳杆稳定小鼠头部后，将面罩置于鼻部以持续输送异氟烷。将小鼠置于加热垫上的毛巾或垫子上，并皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg 体重）以确保术后镇痛。
4. 用标准剃刀剃除头部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用手术剪沿颅骨中线切开皮肤，再用手术钳撑开皮肤。
5. 使用立体定位对准工具将动物头部对准，使前囟（bregma）和后囟（lambda）处于同一水平面，二者之间的高度差应小于50 µm。此外，通过测量在左右两侧规定距离处颅骨表面至前囟的深度，沿正中-侧向轴（mediolateral axis）调平头部。例如， 在前后囟之间左右各1 mm处。如有必要，调整头部倾斜角度。
6. 用3%过氧化氢清洁头部，并用无菌棉片擦干。
7. 根据适当的标准脑图谱，确定颅骨开窗位置相对于前囟的位置。
8. 使用0.9 mm钻头，在小脑上方的颅骨上钻两个螺钉孔，用于放置接地螺钉和参考螺钉。此外，建议再钻1–3个锚定螺钉孔，以稳定植入物。锚定螺钉的位置取决于开颅部位。若植入目标为海马体，则应将锚定螺钉置于对侧顶叶皮层和同侧额叶皮层上方。使用合适的螺丝刀将螺钉旋入颅骨，注意避免穿透脑组织。
9. 使用钻头在植入侧周围呈矩形区域缓慢磨薄颅骨，进行开颅手术。操作过程中应频繁用无菌磷酸盐缓冲液（PB）湿润骨面。剩余的薄层颅骨可用细（27G）注射针头配合镊子轻轻刺破并移除。
10. 用细（27G）注射针小心刺穿硬脑膜。用镊子将针尖弯成小钩状，钩起硬脑膜并将其移除。滴加磷酸盐缓冲液（PB）以防止脑表面干燥。
11. 将电极插入装置安装到立体定位仪支架上，在前囟处校准探针位置归零，然后将探针移至颅骨开窗区域对应的立体定位坐标。缓慢穿透脑表面，确保探针杆不发生弯曲。避免穿过血管进行植入。
12. 缓慢降低探针，直至其位于目标深度上方约200 µm处。用无菌凡士林覆盖颅骨开窗区域及硅探针的探针臂，以作保护。涂抹牙科水泥，将探针基部固定于颅骨的锚定螺钉上。
13. 在涂抹粘合剂后，立即缓慢地将探针推进至目标深度。涂抹粘合剂后，再向前推进约200 µm，可减少探针的横向移动，并确保目标区域的组织损伤最小化。需注意，所用粘合剂的固化时间可能影响本步骤的操作。若使用快速固化的粘合剂，应省略此步骤，并直接将探针植入目标深度，以避免对硅探针造成损伤。
14. 水泥固化后，使用电灼器熔化石蜡，将探针从插入工具上释放。
15. 从植入装置上卸下连接板，并使用连接手柄上附带的鳄鱼夹将其固定在颅骨的合适位置。若将探针植入海马体，则将连接板置于对侧顶骨上，再用牙科水泥将连接板固定在颅骨上。
16. 将连接板的接地线和参考电极线焊接到小脑上方两个螺钉所连接的导线上。
17. 修剪保护套至合适高度，并将其套在硅探针上。使用牙科水泥将保护套固定在连接板和颅骨上，注意避免接触暴露颅骨周围的皮肤。通常无需缝合植入部位周围的皮肤。

3. 术后恢复

1. 至少应用适当的镇痛治疗2天（例如 白天每6小时皮下注射一次布托啡诺，夜间将其加入饮水中，并联合每24小时皮下注射一次卡洛芬（4–5 mg/kg体重）。建议单只饲养，以防止对植入物造成损伤。
2. 至少给予一周的恢复时间。请参考当地动物福利指南。

4. 数据采集

1. 使用通过换向器连接的合适数据采集系统，记录自由活动小鼠的局部场电位（LFP）。采集LFP时，采样频率应为1 - 5 kHz。如果需要同时记录单个神经元放电，则需要更高的采样率（20 - 30 kHz）。
2. 将各个通道的原始记录文件保存下来，用于离线分析。

结果

图1：植入工具示意图。 硅探针固定在一根昆虫针上，昆虫针通过胶粘剂固定于鳄鱼夹的底部。夹持器的杆部可插入立体定位仪的微操装置中，用于探针植入。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带支架的鳄鱼夹	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
硅探针	Cambridge Neurotech	P系列 32
体视显微镜	Olympus	SZ51
漆包铜线	Bürklin Elektronik	89 F 232
接地螺丝	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
助焊剂	Stannol	114018
陶瓷尖镊子	Fine Science Tools	11210-60
石蜡	Sigma-Aldrich	327204
电灼器	Fine Science Tools	18010-00
电烙铁	Kurtz Ersa	OIC1300
乙醇	Carl Roth	9065.1
巴斯德吸管	Carl Roth	EA65.1
热力灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
立体定位仪	David Kopf	Model 1900
立体定位电极夹持器	David Kopf	Model 1900
异氟烷	Abbvie	B506
氧气浓缩器	Respironix	1020007
布托啡诺	Indivior UK Limited
电动剃毛器	Tondeo	Eco-XS
加热垫	Thermolux	463265/-67
手术钳	Fine Science Tools	18050-28
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009
无菌棉片	Carl Roth	EH12.1
钻头	Proxxon	Micromot 230/E
21G注射针头	B. Braun	4657527
磷酸盐缓冲液/磷酸盐缓冲生理盐水
立体定位图谱	Elsevier	9.78E+12
手术剪	Fine Science Tools	14094-11
手术镊	Fine Science Tools	11272-40
27G注射针头	B. Braun	4657705
凡士林
牙科水泥	Sun Medical	SuperBond T&M
卡洛芬	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
记录放大器	Intan Technologies	C3323
USB数据采集板	Intan Technologies	C3004
记录电缆	Intan Technologies	C3216
电旋转连接器	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW