小鼠视网膜切片中神经元的光诱发突触后反应

摘要

来源：Hellmer, C. B.，等。利用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了在暗适应的小鼠视网膜组织切片标本中记录光诱发的突触后反应。将视网膜切片置于记录室中，使用记录电极与视网膜神经节细胞建立电学连续性。施加光脉冲以在神经节细胞中诱发兴奋性突触后电位，并由电极记录这些电位。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 实验溶液的制备

1. 在正式实验前1天至1周内配制解剖液。由于4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液在较低温度下具有较强的缓冲能力，因此用于视网膜解剖。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：115 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl₂、1.0 MgCl₂、10 HEPES、28 葡萄糖。用NaOH调节pH至7.4。溶液可置于冰箱中保存最多1周。
2. 记录液为Ames培养基，这是一种专为视网膜制备设计的人工脑脊液（aCSF）。在实验当天，称取Ames粉末（500 ml溶液需4.4 g）于离心管中。同时称取NaHCO₃（500 ml溶液需0.95 g），并与Ames粉末混合。
3. 在实验当天配制用于膜片钳记录的细胞内电极液。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：111 K-葡萄糖酸盐、1.0 CaCl₂、10 HEPES、1.1 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、10 NaCl、1.0 MgCl₂、5 ATP-Mg和1.0 GTP-Na。用KOH调节pH至7.2。使用常规注射器滤器过滤电极液。分装成约500 µl每份，储存于冷冻或超低温冰箱中。

2. 实验当天的准备工作

1. 实验前一晚，将一只小鼠（C57BL/6J 或类似背景，4–8 周龄，雄性）放入笼中，置于暗处过夜（O/N）进行暗适应。
2. 解剖前准备：
   1. 在玻璃烧杯中加入解剖液（100–200 ml），置于冰上，并持续通氧至少 10 分钟。
   2. 开始对用于视网膜制备物保存的暗盒进行氧气供应。
   3. 准备带有油脂轨道的塑料盖玻片用于视网膜切片制备，并将每张盖玻片放入一个 35 mm 塑料培养皿中。
   4. 在切片机（组织切片器）上安装新的剃须刀片。
   5. 将滤膜剪成两半，用于视网膜切片。
   6. 将解剖工具和移液器放置在解剖显微镜附近，工作区域必须井然有序，以便在黑暗中能方便地取用每一件工具。
3. 膜片钳记录前准备：
   1. 将 Ames 粉末和 NaHCO₃ 溶解于蒸馏水中（Ames 4.4 g 和 NaHCO₃ 0.95 g/500 ml ddH₂O）。将 Ames 培养基在加热至记录温度（约 35 °C）的同时，用混合气体（95% O₂ 和 5% CO₂）持续通气至少 30 分钟。在持续通气过程中，用 NaHCO₃ 将 pH 调整至 7.4。
   2. 在解剖过程中将内液移液管溶液解冻。解冻后，加入 0.01% 的硫罗丹明 B 用于细胞内染色。

3. 视网膜切片制备的膜片钳记录

1. 记录准备：
   1. 用Ames培养基预灌注灌流管。填充管道时，确保所有气泡均排出。
   2. 使用拉制仪制备膜片钳记录电极。将电极后端浸入电极液中约1分钟，直至电极尖端完成回填。随后，使用微量移液器填充器将电极内液填充至电极体积的约1/3。将每根电极存放于湿润的电极盒中。
   3. 打开用于膜片钳记录的设备，包括计算机、放大器、电荷耦合器件（CCD）相机和显微镜。
2. 关闭房间光源。使用红外观察仪将视网膜切片置于显微镜载物台灌流腔内。待切片固定后，开始持续灌流。将灌流液温度设定在33至37 °C。
3. 用CCD相机观察切片表面。聚焦于目标细胞类型所在的目标位置。选择一个形态健康的细胞进行膜片钳记录（即， 表面应光滑，细胞形态良好。
4. 将记录电极放入电极夹持器中。将电极推进至脑片制备物处。当电极接近脑片制备物时（约在上方 2 mm 处），使用显微镜找到电极尖端。一旦在显微镜下可见电极尖端，即将尖端向下移动至目标细胞。
5. 设置放大器。将移液电极调至 0 mV/0 pA（调零），并开始施加约 5 mV、频率约 10 Hz 的连续电脉冲。检测移液电极的电阻；对于大多数视网膜神经元，理想的电阻范围为 5 至 10 MΩ。
6. 从尖端开始吹出。当移液管浸入浴液时，使用吹嘴或注射器施加正压。持续吹出内部溶液，直至移液管尖端到达目标细胞表面。
   1. 当正压在细胞表面形成一个小凹陷时，轻微推进尖端并停止吹气。检查移液管的电阻，其应有所增加。如果电阻持续上升，则保持当前位置并持续监测电阻，直至其达到 >1 GΩ（千兆封接）。如果电阻未自发增加，可轻轻施加负压，直至形成千兆封接。
7. 形成吉欧姆封接后，将钳制电位调整至 -70 mV。随后间歇施加负压，以破裂移液管尖端内的细胞膜。当形成全细胞记录构型时，移液管电阻通常介于 500 MΩ 至 1 GΩ 之间，并可观察到电容电流。有时可记录到自发性突触后电流。
8. 记录 -80 至 +40 mV 范围内的电流-电压（I-V）关系。根据细胞类型的不同，会激活不同类型的电压门控通道。
9. 记录光诱发的突触电流或电压。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠（28-60天龄，雄性）	Jackson laboratory	C57BL/6J 品系
Ames 培养基粉末	Sigma	A1420	效果极佳
红外观察仪	Night Owl Optics	NOBG1	视野明亮，但聚焦小物体存在困难。
便携式红外观察镜	B.E. Meyers	OWL Gen 3 NV pocketscope	视野极佳
拉制仪	Sutter	P-1000	性能优异，可制备出尺寸一致的玻璃微电极。
暗箱	Pelican	dark box	效果极佳
膜片钳系统	Scientifica	slice scope 2000	配置优秀，大多数关键组件均包含在一套系统中。微操纵器性能出色。
放大器	Molecular Devices	multiclamp 700B	性能优异且易于控制。
数据采集软件	Molecular Devices	pClamp software	性能优异且易于控制。
光源（LED）	Cool LED	pE-2 4通道系统	性能优异
CCD相机	Q-imaging	Retiga 2000	性能优异
法拉第笼	自制