小型猪大脑皮层电生理记录用柔性硬膜下皮层电图阵列植入

摘要

来源：Fallegger, F. 等，小型猪硬脑膜下柔性皮层脑电图（ECoG）阵列植入与长期皮层记录。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频展示了在小型猪中植入柔性皮层电图阵列并进行长期皮层记录的过程。视频概述了将阵列通过手术植入小型猪听觉皮层上方，以及记录基础状态和声音刺激诱发的神经元动作电位的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 柔性皮层电图（ECoG）阵列的外科植入

1. 麻醉
   1. 术前给药：将7只年龄为2-6个月（体重5-8 kg）的雌性哥廷根小型猪隔离并禁食过夜。皮下注射咪达唑仑（0.75 mg/kg）、阿托品（0.25 µg/kg）和氟哌啶醇（0.1 mg/kg）的混合制剂，待动物镇静后继续操作。操作前称量动物体重。
   2. 静脉通路建立：
      1. 将动物置于手术台上的加热垫上。通过面罩给予3%-3.5%的七氟烷以诱导麻醉。
      2. 在腹部放置心电图电极，在尾部安装血氧饱和度传感器，并将温度传感器插入鼻腔。
      3. 在耳缘静脉建立静脉通路，并用生理盐水预充的注射器确认回血通畅。使用眼膏保持眼睛湿润。
   3. 气管插管：静脉推注阿曲库铵（0.5 mg/kg）、氯胺酮（1 mg/kg）和芬太尼（1-2 µg/kg）。将动物仰卧位放置以便进行气管插管，插入4.5 mm的气管导管。
   4. 药物维持：插管后停止七氟烷麻醉，开始持续输注丙泊酚（10 mg/kg/h）、芬太尼（2 µg/kg/h）、阿曲库铵（0.2-0.5 mg/kg/h）以及生理盐水（4-7 mg/kg/h）。同时开始输注甘露醇（1 g/kg/h），以减少术中脑肿胀。
      ​注意：若当地动物伦理委员会建议，可采用多模式镇痛方案。
2. 无菌区域与皮肤准备：剃除整个头部毛发，范围需超出手术区域。使用无菌纱布彻底以聚维酮碘（betadine）擦洗头部。随后，在器械台及动物体表铺设无菌巾单，仅暴露手术窗口区域。最后，再次使用无菌纱布蘸取聚维酮碘对头部进行二次消毒。
3. 开颅与硬脑膜切开
   1. 皮肤切口：沿中线使用手术刀切开皮肤。用骨刮匙分离肌肉和骨膜（两侧距前囟25 mm，前后方向距前囟40 mm），并使用牵开器以获得最佳钻孔视野。
   2. 测量与标记：确定前囟（bregma）与后囟（lambda）位置，并用无菌外科记号笔标记（图1A, B）。使用无菌直尺在双侧半球以植入目标为中心划定骨瓣轮廓。本实验中选择听觉皮层作为目标区域，其坐标为从前囟向后-5 mm至-15 mm，外侧偏移-4 mm至-20 mm。根据植入物尺寸及解剖标志调整开颅范围，尽量缩小骨窗大小。
   3. 开颅：
      1. 使用配有圆形切割钻头的骨钻，依据颅骨厚度沿标记线钻孔。钻孔过程中持续用生理盐水冲洗，防止骨组织过热。
      2. 均匀地小心钻透骨板，直至接近硬脑膜。首次穿透后，继续钻至骨板足够薄但尚未完全破裂。然后使用平头刮匙（可在中线或侧方）以开颅边缘为支点，整块撬起骨瓣。若阻力过大，则继续磨薄骨板。
      3. 将取下的骨片置于无菌生理盐水中保存。
      4. 骨瓣移除后，使用Kerison咬骨钳小心修整开颅边缘，避免锐利骨缘损伤硬脑膜。
      5. 若硬脑膜或骨面出血较多，分别使用明胶海绵（Gelfoam）或骨蜡止血。在开颅窗内放置湿敷纱布（浸有无菌生理盐水的标准纱布），然后在对侧半球重复上述步骤（图1B）。
   4. 硬脑膜切开：
      1. 使用6-0缝合包中的针头，在开颅窗的前部或后部、距中线与外侧缘中间位置小心刺破并提起硬脑膜，再用点切刀（stab knife）开始切口。
      2. 随后，将一小块平头刮匙插入硬膜下间隙作为切割支撑面以保护皮层，同时推进点切刀与刮匙，形成一个前后方向的纵行切口。确保切口略宽于植入物（图1C）。若此过程中出现出血或损伤，用明胶海绵覆盖并等待止血。
         ​注意：若硬脑膜存在较大血管，应调整切口路径以避免出血。
4. 植入
   1. 装置置入：
      1. 在装置两侧（图2A）用生理盐水冲洗，使其更易滑入硬膜下腔。将装置置于硬脑膜切口上方，使用小镊子沿切口边缘逐步将其置入硬膜下。
      2. 小心握住装置的基座端，推进植入物以避免产生阻碍插入的张力。当连接器端到达切口上方时，停止推进。
   2. 固定植入物：为固定装置，在电缆穿过颅骨边缘或锚定翼后，放置钛桥并使用合适的螺丝刀以一至两枚钛钉固定（图1D）。
   3. 接地线放置：小心去除接地导线绝缘层约1 cm，并将其置于开颅窗后端的硬膜外（或选择远离目标皮层及大血管的其他硬膜外位置）（导线见图1E）。
   4. 在对侧半球重复上述步骤。
   5. 硬脑膜缝合：使用3-0可吸收缝线及小型持针器，小心地在植入电缆周围缝合硬脑膜。尽可能对合两侧硬脑膜边缘，避免缝线撕裂脆弱的薄膜（图1D, E）。
   6. 骨瓣复位：在每块骨瓣的前部和后部使用钛钉固定钛桥。注意规划钛桥位置，以便后续安装基脚时不影响足板腿的位置。将钛桥末端拧入颅骨（图1F, G）。
5. 基座与足板安装
   1. 定位：本装置的足板具有六条腿，每条腿上有两个螺孔（图2B）。规划足板在颅骨上的位置，以优化螺钉分布（避免将螺钉置于开颅边缘或颞肌内）。若某些螺孔无法拧入，则跳过。
   2. 固定足板：将足板的钛钉拧入，直至其牢固固定（见图1H）。
   3. 安装基座：移除覆盖在连接电缆上的钛桥，翻转基座使其落于足板之上，再将基座拧紧至足板。检查基座是否稳固（图1I）。
6. 缝合与关闭
   1. 创面清理：用生理盐水冲洗皮下间隙，清除骨屑或其他异物。修剪基座周围部分皮肤，形成与圆柱形基座匹配的圆形边缘。
   2. 皮下缝合：移除牵开器，将皮瓣对合。使用4-0不可吸收缝线，间隔3 mm，采用间断或连续缝合法进行皮下缝合。从远离基座处开始，向基座两侧推进。
   3. 皮肤缝合：使用6-0不可吸收缝线，间隔5 mm缝合皮肤。从远离基座处开始，向基座两侧推进。注意确保两皮瓣之间及基座边缘处组织良好对合，避免形成空腔（图1J）。
   4. 伤口包扎：再次使用无菌纱布蘸聚维酮碘清洁伤口区域，并覆盖自粘性无菌敷料。
7. 苏醒：完成所有操作后，停止所有麻醉药物，但仍维持通气支持。为镇痛，贴敷丁丙诺啡透皮贴剂（25 mg/h）持续24小时。将动物置于覆盖无菌巾单的加热垫上以加快苏醒。当自主呼吸恢复后，拔除气管导管，并给予面罩吸氧直至意识完全恢复（通常需1至4小时）。
8. 术后动物护理：术后5天内密切观察动物状态。每日两次随食物给予头孢氨苄（75 mg），并与其它动物隔离。每日使用浸透聚维酮碘的无菌纱布充分消毒伤口（建议在喂食期间进行）。
   注意：长期护理与饲养：术后动物隔离24小时。若动物状态良好，可重新放回原社交群体。需每日观察基座及皮肤开口情况，监测装置在头部的整合状况。必要时，使用大量聚维酮碘清洁基座周围区域。

2. 电生理记录

1. 自发活动：通过基座连接无线记录系统，记录 2-3 分钟的基础活动。这些记录将作为对照，用于分析听觉诱发电位。
2. 听觉诱发电位：除无线系统外，在动物耳内插入扬声器，置于封闭声场中。以约 70 dB 声压级（SPL）播放不同频率（范围为 200-20,000 Hz）的短音脉冲声学刺激，重复 120 次。然后对记录信号进行平均，并在刺激时段内对齐以供分析。
3. 感觉诱发电位：在吻部三个不同位置插入针电极。通过脉冲发生器以不同刺激强度对吻部施加约 30 秒的刺激，以获取招募曲线。

3. 自由活动记录

1. 按照第2节中所述的相同步骤，记录大脑的清醒信号。可通过将动物抱在实验者臂中或用零食分散其注意力的方式，连接无线头戴装置。使用放置在动物附近的外部扬声器提供声学刺激。

结果

图1：柔性ECoG电极在脑部的微创植入。 (A) 颅骨手术入路，标示前囟位置。(B) 双侧开颅，硬脑膜清晰可见。(C) 第一侧半球的硬脑膜切开。(D) 柔性ECoG电极的硬膜下植入及硬脑膜闭合。(E) 第二侧半球的硬脑膜切开；使用钛桥固定第一侧半球的骨瓣。(F) 第二侧半球柔性ECoG电极的植入及硬脑膜闭合。(G) 第二侧半球骨瓣的固定。(H) 底板在颅骨上的定位。(I

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
骨钻	BBraun	Elan 4 配 GA861 手柄
骨钻头	BBraun	Neurocutter GP204R
骨蜡	Ethicon	W31G
导管	Venisystems	Abbocath 14G
明胶海绵	Pfizer	Gelfoam
插入式耳机	Etymotic	Etymotic ER2 插入式耳塞
恒电位仪	Gamry Instruments	Reference 600
脉冲发生器	AM Systems	Model 2100 隔离式脉冲刺激器
记录前置放大器	Multichannel systems	W2100-HS32
记录系统	Multichannel systems	W2100
螺丝刀	Medtronic	手柄：001201，轴：8001205
穿刺刀	Fine Science Tools	10316-14
皮肤缝合线	Ethicon	Vicryl 2-0
硬脑膜缝合线	Ethicon	Mersilk 5-0
提拉硬脑膜用缝合线	Ethicon	Prolene 6-0 配 BV-1 针
皮下缝合线	Ethicon	Vicryl 4-0
钛桥	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	裁剪至所需尺寸
钛螺钉	Medtronic	9001635, 9001640
X射线系统	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm