硬膜下植入软皮层电图阵列，用于小型猪皮质电生理记录

Abstract

来源:Fallegger， F. et al.， 硬膜下软皮层电图（ECoG）阵列植入和小型猪的长期皮层记录。J. Vis. Exp. （2023 年）。

该视频演示了小型猪软皮层电图阵列的植入和长期皮质记录。它概述了通过手术将阵列植入迷你猪的听觉皮层并记录基线和声音刺激诱发的神经元动作电位所涉及的步骤。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 手术植入软皮层电图 （ECoG） 阵列

1. 麻醉
   1. 术前用药:在 2-6 个月大 （5-8 kg） 时分离雌性哥廷根迷你猪 （n = 7） 并禁食过夜。皮内注射 0.75 mg/kg、0.25 μg/kg 的阿托品和 0.1 mg/kg 的哈多的混合物，并等待动物镇静。在继续之前给动物称重。
   2. 安装静脉 （IV） 导线:
      1. 将动物放在手术台上的加热垫上。通过在动物身上放置面罩来诱导麻醉，使用 3%-3.5% 的七氟烷。
      2. 将心电图导线放在腹部，将血氧饱和度传感器放在尾部，将温度传感器放在鼻孔中。
      3. 将静脉导联导线放在耳静脉上，并使用装满生理盐水的注射器确认血液通路。使用软膏确保眼睛保持水分。
   3. 插管:推注 0.5 mg/kg 的阿曲库铵、1 mg/kg 的氯胺酮和 1-2 μg/kg 的芬太尼。将动物仰卧插管。插入 4.5 mm 管。
   4. 药物:插管后，停止七氟烷麻醉，以 10 mg/kg/h 的速度输注异丙酚，以 2 μg/kg/h 的速度输注芬太尼，以 0.2-0.5 mg/kg/h 的速度输注阿曲库铵，以 4-7 mg/kg/h 的速度输注盐水。以 1 g/kg/h 的速度开始输注甘露醇，以减少手术过程中的脑肿胀。
      注意:如果当地动物伦理委员会推荐，可以使用多模式镇痛方案。
2. 无菌区域和皮肤准备:剃除手术区域以外的整个头部表面。使用无菌垫，用 betadine 彻底擦洗头部。接下来，将无菌窗帘放在器械台和动物身上，只露出手术窗。最后，用含有 betadine 的无菌垫再次擦洗头部。
3. 开颅手术和硬脑膜切开术
   1. 皮肤切割:用手术刀沿中线切开皮肤。使用锭形刀将肌肉和骨膜（两侧前囟外侧 25 毫米，前囟前后 40 毫米）与骨骼分开，并放置扩张器，以便为以后的钻孔获得最佳通道。
   2. 测量和标记:识别前囟和 lambda 并用无菌手术笔标记它们（图 1A、B）。使用无菌尺，定义以两个半球的植入目标为中心的骨瓣轮廓。在这种特定情况下，选择了听觉皮层，前囟坐标为 -5 毫米至 -15 毫米，横向坐标为 -4 毫米至 -20 毫米。然后，根据植入物和解剖标志的大小调整开颅手术，限制开口大小。
   3. 颅骨切开术:
      1. 使用带有圆形切割钻头的骨钻，考虑到颅骨的厚度，钻出开颅手术的轮廓。用盐水溶液冲洗钻孔位置，以避免骨骼过热。
      2. 小心地均匀地钻孔轮廓，直到到达硬脑膜。在第一次突破时，完成轮廓的钻孔，直到它变薄到几乎可以突破。然后，使用平铲（在中线或外侧）将骨瓣分成一块，以开颅手术边缘为杠杆。如果遇到太大的阻力，请继续减薄骨骼。
      3. 将骨块放入无菌盐水中。
      4. 取出骨瓣后，小心地将开颅手术的边缘削掉，使用 Kerison 避免锋利的骨边缘切入硬脑膜。
      5. 如果硬脑膜或骨骼出血过多，请分别使用 Gelfoam 或骨蜡。在开颅手术中放置湿敷布（无菌盐水溶液中的标准垫），并在另一个半球重复此步骤（图 1B）。
   4. 硬骨切开术:
      1. 使用 6-0 缝合套件中的针头，小心地刺穿并抬起开颅手术前端或后端的硬脑膜，在内侧和外侧之间，然后用刺刀创建切口的起点。
      2. 然后，使用插入硬膜下腔的小扁刮刀作为切割底座以保护皮层，通过同时使用两种工具前进，在硬脑膜上创建一个前后裂缝。确保狭缝略大于植入物的宽度（图 1C）。如果此步骤出现任何出血或损坏，请用凝胶泡沫覆盖并等待其停止><。 注意:如果硬脑膜中存在大血管，则应调整裂隙轨迹以避免出血。
4. 着床
   1. 设备插入:
      1. 用生理盐水冲洗植入物（图 2A），使其更容易滑入硬膜下腔。将植入物放在硬脑膜裂缝上方，然后用小镊子在每个边缘依次滑动装置，将其硬膜下插入装置。
      2. 小心握住装置的基座端并与植入物一起前进，以免产生阻碍插入的张力。当连接器边缘位于狭缝顶部时，停止插入。
   2. 固定植入物:要将植入物固定到位，请在开颅手术边缘后的电缆上或锚固翼中放置一个钛桥，并使用适当的螺丝刀用一个或两个钛螺钉固定（图 1D）。
   3. 接地放置:小心地去除 1 cm 的接地线绝缘层，并将其硬膜外插入开颅手术的后端（或任何远离感兴趣皮层或大血管的硬膜外位置）（图 1E 中的电线）
   4. 在对侧半球上重复这些步骤。
   5. 硬脑膜闭合器:使用 3-0 可吸收缝合线和小针架在种植体电缆周围小心地缝合硬脑膜。将两个硬脑膜边缘尽可能地放在一起，不要用缝合线撕裂薄膜（图 1D，E）。
   6. 骨瓣放置:使用钛螺钉将钛桥固定在每个骨瓣的前部和后部。在接下来的步骤中，请仔细规划 Ti 桥相对于脚踏板腿的位置。将钛桥的末端拧到头骨上（图 1F，G）。
5. 基座和脚踏板放置
   1. 定位:在这种配置中，脚踏板有六个腿，每个腿有两个螺丝孔（图 2B）。计划脚踏板在颅骨上的位置，以优化螺钉的位置（避免将它们放置在开颅手术的边缘或颞肌中）。如果无法拧入腿上的孔，请跳过它们。
   2. 脚踏板固定:拧入脚踏板的钛螺钉，直至其牢固就位（参见图 1H）。
   3. 底座放置:拆下连接电缆上的钛桥，然后翻转底座以落在踏板上。将底座拧到脚踏板上。检查底座是否牢固就位（图 1I）。
6. 缝合和闭合
   1. 清洁伤口:用生理盐水冲洗清洁皮下空间的任何骨头或其他碎屑。切掉基座边缘周围的一些蒙皮，以沿着圆柱体创建一个圆形边缘。
   2. 皮下缝合:取下吊具并将皮瓣折叠在一起。使用简单的间断缝合线或简单的连续缝合线，用 4-0 不可吸收的缝合线（相距 3 毫米）创建皮下缝合线。从基座开始，在切口的两侧向基座移动。
   3. 真皮缝合线:使用 6-0 不可吸收的缝合线缝合皮肤，缝合线相距 5 毫米。从基座开始，在切口的两侧向基座移动。注意在两个皮瓣之间和基座边缘附近实现良好的组织贴壁，以避免空隙（图 1J）。
   4. 伤口敷料:用无菌垫和优碘再次清洁伤口区域。在伤口上贴上自粘无菌绷带。
7. 觉醒:完成所有测量后，将动物从所有麻醉剂中取出，但保持通风。对于镇痛，使用丁丙诺啡贴剂 （25 mg/h） 24 小时。将动物放在覆盖有窗帘的加热垫上，以加快唤醒时间。当自主呼吸恢复时，将动物拔管并戴上氧气面罩，直到意识恢复（可能需要 1 到 4 小时）。
8. 术后动物护理:在 5 天内，密切监视动物。每天两次服用 75 毫克的头孢氨苄，与其他动物分开。每天用浸泡过的无菌垫涂抹大量优碘对伤口进行消毒（最好在喂食时进行><）。 注意:长期护理和住房:将手术动物隔离 24 小时。如果动物身体状况良好，可以与同伴进行社交互动，它就会被放回原来的社会群体中。需要每天观察基座和皮肤开口，以跟踪设备在头部的整合。适当时，用大量的 betadine 清洁基座周围的位置。

2. 电生理记录

1. 自发活动:将无线记录系统插入底座并记录基线活动 2-3 分钟。这些录音将用作分析听觉诱发电位的对照。
2. 听觉诱发电位:除了无线系统外，还将扬声器插入动物耳朵的封闭区域。在重复 120 次中，以大约 70 dB 的声压级 （SPL） 在不同频率（范围从 200-20,000 Hz）播放音调突发声学刺激。然后，对录音进行平均，并在刺激期内对齐它们以进行分析。
3. 感觉诱发电位:将针头放在鼻子的三个不同位置。通过用不同幅度的脉冲发生器刺激鼻子 ~30 秒来唤起感觉电位，以获得募集曲线。

3. 自由移动的录音

1. 按照第 2 节中描述的相同程序记录来自大脑的清醒信号。通过将动物抱在实验者的怀里或用零食喂动物以分散它的注意力来插入无线头级。使用放置在动物附近的外部扬声器提供声学刺激。

Results

图 1:将软 ECoG 微创植入大脑。（A） 手术进入颅骨，有前囟的迹象。（B） 可见硬脑膜的双侧开颅手术。（C） 第一半球的裂隙硬膜切开术。（D） 软 ECoG 和硬脑膜闭合的硬膜下植入。（E） 第二半球的裂开硬膜切开术。使用钛桥在第一半球固定骨瓣。（F） 在第二半球植入软 ECoG 和硬脑膜闭合。（G） 第二半球的骨瓣固定。（H） 脚踏板在颅骨上的位置。（I） 基座固定在脚踏板上。（J） 基座基部周围的皮肤闭合。

Materials