小鼠海马-内嗅皮层脑片局部场电位记录

摘要

来源：Whitebirch, A. C. 利用急性小鼠脑切片研究海马区自发性神经网络活动。J. Vis. Exp. (2020)

该视频演示了在小鼠海马-内嗅皮层脑片中记录局部场电位（LFP）的操作步骤。在海马CA3区辐射层施加电刺激，可引起CA1区锥体细胞层突触后电位的变化。CA1神经元膜电位的总体变化被称为局部场电位，本实验即对此进行记录。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 经心灌注

1. 将一个容量为 60 mL 的注射器作为蔗糖切片液的储液罐，悬挂在实验台面上方约 18 英寸处（例如，使用垂直支架上的三叉旋转夹）。将管路连接至储液罐底部，穿过滚轴夹，再将管路另一端连接至一根洁净的 20 G 针头。
2. 向 60 mL 储液罐中加入约 30 mL 冰冷的蔗糖溶液，并将碳氧混合气（carbogen）导管插入蔗糖储液罐中，持续向灌注液中通气。
   注意： 确保蔗糖溶液在管路和针头中流动顺畅，无气泡滞留。流速应调节至刚好使针头持续稳定地滴出蔗糖液滴。
3. 使用搅拌器将冷冻的蔗糖打碎并搅拌成冰浆状，然后用大刮勺或大勺将冰浆均匀铺开。
   1. 在玻璃培养皿盖的边缘周围放置少量蔗糖冰浆，并在培养皿底部也加入少量蔗糖冰浆。
   2. 向灌注液储液罐中加入约 20–30 mL 蔗糖冰浆，与其中 30 mL 冰冷液态蔗糖充分混合，使储液罐内形成以极冷液态蔗糖为主、含有部分残余冷冻成分的混合液。
4. 将小鼠放入连接异氟烷蒸发器的麻醉舱中。以约 2 L/min 的氧气流速，将蒸发器旋钮调至 5% 异氟烷浓度，并启动计时器。
   注意： 从此时起保持计时器持续运行，用于评估切片获取的速度。整个操作应尽快完成，确保在小鼠进入异氟烷麻醉舱后 15–20 分钟内完成切片，并将组织转移至界面式孵育室中恢复。密切观察小鼠，确保其达到深度麻醉状态。至少 5 分钟后，小鼠应处于深度麻醉状态，对脚趾夹捏无反应。
5. 在将小鼠从异氟烷麻醉舱中取出前，立即向培养皿盖中加入冰冷蔗糖溶液，深度约为 3–5 mm；向培养皿底部加入冰冷蔗糖溶液，深度约为 1.0 cm。
6. 迅速将小鼠转移至左侧吸水垫上，使用三段胶带固定前肢和尾部。进行后肢脚趾夹捏测试，确认小鼠无反应后方可进行任何切口操作。使用大号组织镊和手术剪，提起皮肤并在胸骨下缘至胸部顶端之间做纵向切口。用镊子提起胸骨，用剪刀剪开膈肌。
   注意： 小鼠的初始定位及切断膈肌的前几项操作应尽可能迅速，以防止小鼠恢复意识。为确保整个操作过程中麻醉深度足够，可在灌注期间将鼻式麻醉管置于小鼠鼻部持续给予异氟烷。
7. 使用剪刀从两侧剪开肋骨，以一次大幅度动作剪至前肢与躯干连接处。用镊子将胸骨前部向上并向头部方向掀开，再用大剪刀水平剪切将其完全移除。用大镊子固定心脏位置，将 20 G 灌注针头插入左心室。当针头位置正确时，随着冰冷蔗糖溶液注入心室，心脏左侧应迅速变苍白。
8. 使用小型解剖剪剪开右心耳，使血液从循环系统中流出。若切口操作正确，心脏应无明显损伤，并在整个灌注过程中持续跳动。
   注意： 可使用卷成小团的纸巾吸除心脏周围的血液和蔗糖溶液，以保持操作视野清晰，便于观察灌注针位置。
9. 确保灌注针保持在原位，不从左心室脱落。当流速和位置适当时，肝脏将在 20–30 秒内开始变苍白，呈现浅黄褐色/米色。
10. 灌注 30–45 秒后，使用大剪刀将小鼠断头。用左手握住头部，将皮肤从颅骨上推离或剥离。在灌注良好的动物中，颅骨应非常苍白，透过颅骨可见脑组织呈极淡的粉红色（接近白色），且无明显可见的血管。

2. 提取大脑并切割成切片

1. 使用小型邦氏剪刀，在靠近眼睛的颅骨前部，从两侧向中线方向在颅骨上做两个侧向切口。在颅骨基底部两侧再做两个额外的切口。
2. 将头部转移至玻璃培养皿底部，使其大部分浸没在冰冷的蔗糖溶液中。使用小型邦氏剪刀沿颅骨全长的中线向下剪开，剪切时轻轻上提剪刀，以尽量减少对下方脑组织的损伤。用小型组织镊子牢固夹住颅骨两侧，像打开一本书一样将其向上并向外翻起，远离脑组织。
3. 用左手手指固定颅骨翻开的骨瓣，将微型解剖刀插入嗅球附近的脑组织下方。将脑组织翻出至蔗糖溶液中，并用微型解剖刀切断脑干。清洗脑组织，去除残留的血液、毛发或其他组织。
4. 使用大号刮刀/勺子将脑组织转移至玻璃培养皿的皿盖上。取之前预留的双面剃刀片的另一半，进行两次冠状切面切割，先切除小脑，再切除包括嗅球在内的最前部脑组织（图1）。
5. 在琼脂斜坡上涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。用大号组织镊子将脑组织短暂地放置在一片干燥滤纸上，然后立即转移至琼脂斜坡上，使脑腹侧面贴附于粘合剂上。
   注意： 若需制备中间部位海马切片，应将脑组织前端朝向斜坡上方，后端靠近刀片；若需制备腹侧海马切片，则应将脑前端朝向斜坡下方，后端位于斜坡顶端，离刀片更远。无论哪种情况，脑组织均应置于斜坡顶端，使脑的冠状切面与琼脂背衬块接触（图1）。
6. 将带有琼脂和脑组织的切片平台放入切片机的切片室中，并完全浸入冰冷的蔗糖溶液。使用大号刮刀/勺子向切片室中转移一些蔗糖浆液，搅拌以融化可能冻结的蔗糖，并迅速将混合液温度降至约1–2 °C。
   注意： 切片过程中持续观察温度计。若蔗糖溶液温度超过3 °C，应添加更多浆液并搅拌，使温度重新降低。
7. 使用切片机以0.07 mm/s的速度切割厚度为450 μm的脑片。每切下一刀后，使用小型组织镊子和锋利的手术刀片，先将两个半脑分离，再切除周围组织，直至切片主要包含海马及旁海马区域（图1）。
8. 使用塑料移液管将切片逐一转移至界面式恢复室中，确保切片位于人工脑脊液（ACSF）与空气的交界面上，仅由一层薄薄的ACSF液面覆盖。严密关闭恢复室盖子，使切片在32 °C条件下恢复30分钟。
9. 在32 °C初始恢复后，将界面式恢复室从水浴中取出，置于低速搅拌器上，使磁力搅拌子在室内促进ACSF循环。让其随切片继续恢复90分钟，逐渐冷却至室温。确保恢复室持续通入碳合气（carbogen），并避免大气泡滞留在切片下方。

3. 记录自发活动的局部场电位（LFP）

1. 启动所有必要的设备以准备进行局部场电位（LFP）记录，包括运行采集软件的计算机、连接至计算机的显示器、刺激器、显微操作器、温度控制器、显微镜光源、显微镜附带的相机、微电极放大器、数据采集器以及蠕动泵。若使用中央真空系统，请打开墙壁上的阀门，以准备用于从记录室中移除人工脑脊液（ACSF）的真空管路。
2. 将加热储液罐中加入ACSF，然后将一段输液管的一端插入盛有持续通气ACSF的400 mL烧杯中。开启蠕动泵，使ACSF从400 mL烧杯流入加热储液罐，并进一步输送至记录室。轻敲或捏压输液管以排出其中可能滞留的气泡。
3. 调节蠕动泵，确保ACSF流经记录室的流速较快（约8–10 mL/min）。使用温度探头测量，确保记录室中心位置的ACSF温度为32 °C。
   注意：若使用蠕动泵向记录室输送ACSF，较高的流速可能导致明显的流量波动。可通过在管路中集成一组空注射器构成的简单脉动阻尼器来实现稳定的流速（图2）。
4. 使用加热丝拉制仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管制备刺激和记录用移液管。拉制程序应设置为获得电阻为2–3 MΩ的移液管，适用于刺激或局部场电位记录电极。
5. 用1 M NaCl填充刺激移液管，用ACSF填充LFP记录移液管。
6. 短暂夹闭输液管并关闭泵，暂停ACSF流动。使用精细镊子夹住切片下方的滤纸一角（切片会粘附在滤纸上），将脑片转移至记录室。将滤纸连同脑片一起放入记录室，使脑片朝下，然后“剥离”滤纸，使脑片完全浸没于记录室中。使用网格状固定器（harp）固定脑片。
   注意：网格状固定器可购买成品，也可在实验室内使用U形不锈钢或铂金丝及细尼龙丝自制。
7. 将装有NaCl溶液的刺激移液管安装至手动显微操作器上，并以约30–45°的角度缓慢将其尖端推进至脑片表面（例如stratum radiatum层）。一旦移液管尖端进入组织，应缓慢向前推进，避免在横向或垂直方向进行大幅度移动，以防不必要的轴突损伤。将移液管尖端置于至少50–100 μm深的脑片内部，以避开切片过程中受损的表层细胞。
8. 将装有ACSF的LFP移液管插入连接至电动显微操作器的移液管夹持器中。通过口吸压力或连接三通阀和短段管路的1 mL注射器，对移液管施加轻微的正压。
   注意：应将LFP移液管置于脑片内适当位置以记录目标信号：对于尖波涟漪（sharp wave ripples），一支LFP移液管应置于stratum pyramidale（SP）层，另一支置于stratum radiatum（SR）层。该配置可同时记录SR层的负向尖波和SP层的高频涟漪振荡（图3）。
9. 使用显微操作器，以约30–45°的角度将LFP移液管尖端缓慢推进至目标区域（例如CA1锥体细胞层）。将移液管尖端置于至少50–100 μm深的脑片内部，以避开切片过程中受损的表层细胞。在推进LFP移液管过程中，持续通过采集软件施加小电压测试脉冲，并观察电极电阻是否突然升高。该现象可能提示移液管被堵塞或紧压在细胞上。
10. 当LFP移液管定位至目标区域后，小心打开连接移液管夹持器的管路上的阀门，逐步释放正压。
11. 若需同时在第二个位置记录LFP，请使用第二支移液管和显微操作器重复步骤6.8–6.10。
12. 将微电极放大器设置为电流钳模式，并在采集软件中使用桥式平衡功能校正移液管的串联电阻后，记录局部场电位中的自发活动。自发性尖波涟漪（SWRs）将在SP层的细胞外电位中表现为正向偏转（图3）。
13. 为记录诱发电位，使用连接至数据采集器的刺激器，通过装有NaCl溶液的刺激移液管施加短暂（200 μs）的方波电压脉冲。调节刺激电压旋钮，以诱发不同幅度的反应。

结果

图1：水平倾斜海马-内嗅皮层（HEC）切片的制备。（A）（i）取出脑组织后，使用刀片进行两次冠状面切割，以去除脑的后部和前部组织。（ii）琼脂斜坡由两个粘合在切片机平台上的倾斜部分构成。为制备中间部位海马的切片，将脑组织块置于琼脂斜坡上，使其前表面朝上并紧贴斜坡较高侧的支撑部分；为制备更腹侧的海马切片，则将脑组织块置于琼脂斜坡上，使其前表面朝下，使后部切割面与斜坡较高侧的支撑部分接触。（iii）每当切下一片组织时，使用手术刀再进行数次切割，以分离两侧半球并去除不必要的组织。（B）DAPI...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
急性脑切片孵育支架	NIH 3D 打印交流平台	3DPX-001623	由 ChiaMing Lee 设计，网址 https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
腺苷-5′-三磷酸镁盐	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl 接地颗粒	Warner	64-1309, (E205)
琼脂	Becton, Dickinson	214530-500g
抗坏血酸	Alfa Aesar	36237
烧杯（250 mL）	Kimax	14000-250
烧杯（400 mL）	Kimax	14000-400
生物素标记物（biocytin）	Sigma Aldrich	B4261
搅拌器	Oster	BRLY07-B00-NP0
小型邦剪刀（Bonn scissors）	Becton, Dickinson	14184-09
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cm）	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	建议使用火焰抛光的毛细管。
氯化钙溶液（1 M）	G-Biosciences	R040
相机	Olympus	OLY-150
压缩碳合气体（95% 氧气 / 5% 二氧化碳）	Airgas	X02OX95C2003102
压缩氧气	Airgas	OX 200
恒压隔离刺激器	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
盖玻片（22x50 mm）	VWR	16004-314
氰基丙烯酸酯粘合剂	Krazy Glue	KG925	建议使用刷涂型以提高精确度
数据采集软件	Axograph	N/A	任何等效软件（例如 pClamp）均可使用。
Dell Precision T1500 塔式工作站台式机	Dell	N/A	目录号将取决于具体计算机型号——只要能运行电生理数据采集软件，任何计算机均可使用。
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
数字计时器	VWR	62344-641	4通道 Traceable 计时器
一次性吸水垫	VWR	56616-018
解剖剪刀	Fine Science Tools	14082-09
双刃剃须刀片	Personna	BP9020
双通道自动温度控制器	Warner Instrument Corporation	TC-344B
双表面或层流优化记录室	N/A	N/A	本方案中使用的记录室为定制装置。商用等效产品为 Warner Instruments 的 RC-27L。
设备机架	Automate Scientific	FR-EQ70"	机架并非绝对必要，但有助于电生理设备的整理
乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）	Sigma Aldrich	324626-25GM
滤纸	Whatman	1004 070
精密天平	Mettler Toledo	XS204DR
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-97
玻璃培养皿（100 x 15 mm）	Corning	3160-101
葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1
鸟苷-5′-三磷酸钠盐水合物	Sigma Aldrich	G8877-250MG
冰桶	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
异氟烷蒸发器	General Anesthetic Services	Tec 3
实验室胶带	Fisher Scientific	15-901-10R
镜头纸	Fisher Scientific	11-996
光源	Olympus	TH4-100
氯化镁溶液（1 M）	Quality Biological	351-033-721EA
磁力搅拌子	Fisher Scientific	14-513-56	目录号取决于搅拌子的尺寸。
显微操作器	Luigs & Neumann	SM-5
显微操作器（手动）	Scientifica	LBM-2000-00
显微镜	Olympus	BX51WI
微型刮勺	Fine Science Tools	10089-11
显示器	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B 微电极放大器	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	MultiClamp 700B 应包含前置放大器、移液器夹持器和模型细胞。
N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)（HEPES）	Sigma Aldrich	H3375-25G
针头（20 号，长度 1.5 英寸）	Becton, Dickinson	305176
尼龙丝线	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	规格 0.004。此货号来自 Amazon.com
尼龙网	Warner Instruments Corporation	64-0198
蠕动泵	Harvard Apparatus	70-2027
磷酸肌酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐	Sigma Aldrich	P1937-1G
移液器夹持器	Molecular Devices	1-HL-U
铂丝	World Precision	PT0203
聚乳酸（PLA）丝材	Ultimaker	RAL 9010
氯化钾	Sigma Aldrich	P3911-500G
葡萄糖酸钾	Sigma Aldrich	1550001-200MG
氢氧化钾	Sigma Aldrich	60377-1KG
剃须刀片	VWR	55411-050
滚压夹	World Precision Instruments	14041
天平	Mettler Toledo	PM2000
手术刀柄	Fine Science Tools	10004-13
切片固定架（slice harp）	Warner	SHD-26GH/2
碳酸氢钠	Fisher Chemical	S233-500
氯化钠	Sigma Aldrich	S9888-1KG
无水磷酸二氢钠	Fisher Chemical	S369-500
丙酮酸钠	Fisher Chemical	BP356-100
刮勺	VWR	82027-520
大刮勺/药勺	VWR	470149-442
无菌手术刀片	Feather	72044-10
搅拌器/加热板	Corning	6795-220
单向旋塞阀	World Precision Instruments	14054
三通旋塞阀	World Precision Instruments	14036
蔗糖	Acros Organics	AC177142500
旋转夹具支撑架	Fisher Scientific	14-679Q
手术剪刀，尖/钝头	Fine Science Tools	14001-12
注射器（1 mL）	Becton, Dickinson	309659
注射器（60 mL，带鲁尔锁头）	Becton, Dickinson	309653
三爪夹	Fisher Scientific	05-769-8Q
大组织镊	Fine Science Tools	11021-15
小组织镊	Fine Science Tools	11023-10
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M
管路	Tygon	E-3603	内径 1/16 英寸，外径 3/16 英寸
管路	Tygon	R-3603	内径 1/8 英寸，外径 1/4 英寸
真空润滑脂	Dow Corning	14-635-5D
振动刀片式切片机	Leica	VT 1200S
带法拉第笼的防震台	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
容量瓶（1 L）	Kimax	KIM-28014-1000
容量瓶（2 L）	PYREX	65640-2000
温水浴	VWR	1209