联合记录小鼠毛囊机械刺激传入神经输出与神经末梢标记

摘要

来源：Bewick, G. 等，小鼠毛囊梭形末梢机械刺激传入输出与神经末梢标记的联合记录。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了在小鼠耳廓毛囊中，机械刺激传入神经输出与神经末梢标记的联合记录技术。该方法概述了在暴露于荧光膜染料前后对毛囊神经末梢进行机械刺激的操作步骤、所产生动作电位的电生理记录，以及毛囊内神经末梢标记的可视化过程。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 电生理记录装置设置

1. 用精细的昆虫针将小鼠耳廓皮肤固定在记录室底部涂有PDMS的基底上，针数约为每耳6-8枚，围绕耳缘分布，使清理后的神经位于耳基部，并靠近两个吸吮电极——其中一个为记录电极（用于采集神经信号），另一个为无关电极（为差分放大器提供中性信号）。
2. 对于记录电极，需仔细匹配其开口孔径与内部直径，使其与两条神经的总厚度相适应，以确保神经尽可能紧密且最大程度地插入电极内。
3. 通过连接在电极另一端的硅胶管，使用2 ml注射器施加轻柔的负压，将神经吸入电极内。确保神经保持平直，无折叠或重叠。
4. 通过施加更强的负压，将结缔组织或脂肪组织吸入电极，形成堵塞物，从而在神经周围紧密封闭开口，建立高电阻/阻抗的连接。
5. 如有必要，通过负压将生理盐水注入另一个（无关）电极内（也可依赖毛细作用自然填充）。
6. 将相同的记录导线（银或铂）插入记录电极的内孔中，使其接触盐水和神经（记录端），或电极的缩窄并经火焰抛光的末端（无关端）。每个电极分别焊接至双芯屏蔽电缆的不同芯线上。将浴槽（接地）电极（Ag/AgCl小球）放入浴液中，并将其连接至与记录电极相连的双芯电缆的屏蔽层上。
7. 将两个电极的电信号分别输入差分放大器的不同通道，经带通滤波（0.2-2 kHz），并在示波器屏幕上观察。检查通道A（记录）与通道B（无关）的电噪声水平是否相近。在此阶段，由于两个电极尚未平衡，可能尚无法在通道A中观察到正常的自发动作电位。
8. 通过进一步将疏松（脂肪）结缔组织吸入任一电极，和/或使用50 ml注射器施加更大的负压，调节记录电极（通道A）或无关电极（通道B）的阻抗，以消除两电极间背景噪声的差异。
   1. 以这种方式实现“平衡”后，切换回差分（A-B）记录模式，观察示波器波形中是否存在自发动作电位（APs），或在轻刷耳廓边缘毛发时是否出现信号。若未见任何活动（放电），需重新检查神经在记录电极中的紧密程度以及无关电极中疏松结缔组织的密封情况——通常，密封越紧密（电阻越高），两电极阻抗越接近，记录质量越好。通过练习，可获得高质量的信噪比（>2:1）。
9. 通过连接计算机的实验室接口和运行电生理软件记录神经电图。放电的音频输出非常有用，可通过将神经电图信号输入音频放大器及配套扬声器实现。调节阈值至略高于基线噪声水平（以无白噪声“嘶嘶”声为准）。
10. 为增强药物或荧光苯乙烯染料对梭形末梢的通透性，小心剥离耳廓边缘附近的皮下脂肪层，形成一个约5 mm × 5 mm的窗口，暴露真皮层及毛囊基部（图1A，B）。
11. 将耳缘前方约1 mm宽、已清除脂肪的皮肤褶皱用针固定回位，使相对的皮肤层之间留出一个充满生理盐水的清晰间隙。用针或接地的精细镊子轻轻刷动沿折叠边缘伸出的毛发，避免接触皮肤，以在示波器上定位动作电位输出最强的区域，并在音频输出中识别出特征性的“咔哒”和“爆裂”声。

2. 记录刺激诱发的动作电位

1. 将机械刺激探针——一端为经火焰抛光的10 cm硼硅酸盐微电极玻璃，连接至陶瓷压电驱动器——放置于与皮肤皱褶平行的位置。将探针尖端置于距离皮肤皱褶约0.5–1 mm处，使其接触毛发但不接触皮肤。通过手动缓慢移动探针尖端以偏转毛发，并观察或监听神经放电情况，从而验证刺激是否有效。
2. 使用软件控制对1-3根毛发进行机械刺激例如 每10秒施加一次持续3秒、频率为5 Hz的正弦波刺激（探针位移200–500 µm），记录神经中刺激诱发的反应。
3. 以10秒间隔给予数次相同的机械刺激序列。优化探针位置以确保可重复性，然后根据实验方案降低刺激频率。例如 将重复间隔从10秒缩短至30秒。
4. 使用软件区分类似动作电位（AP）的活动，例如，设定一个简单的阈值，约为高频噪声幅度的2倍，并约为最大动作电位的25%。
5. 将跨过阈值的动作电位计为“事件”，以量化所产生的动作电位的频率和特征。

3. 记录刺激诱发的放电活动并结合N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物标记

1. 为了检测苯乙烯染料对刺激诱发的传入神经放电及末梢标记的影响，将所选苯乙烯染料的适当浓度加入灌流液中，并继续进行电生理记录。
2. 经过所需的染料孵育时间（通常至少30分钟）后，准备标本以观察毛囊。移除固定针以展开皮肤瓣，暴露透明的真皮区域，以显示末梢标记情况。
3. 用不含染料的生理盐水冲洗去除外部残留染料，共更换三次生理盐水。
4. 在最后一次充氧的无染料生理盐水中孵育10–15分钟，使残留在暴露/外部膜上的染料尽可能充分洗脱。
5. 使用螯合剂（磺丁基化β-环糊精，1 mM，5分钟）在生理盐水中去除仍停留在膜表面但未被内化的残留染料。
6. 将记录室转移至直立式落射荧光显微镜的载物台上，并将记录室与载物台/玻片移动装置连接固定。
7. 使用适合该苯乙烯染料的激发光照射标本。采用10X或25X荧光物镜观察毛囊的标记情况（图1）。

结果

图1：电生理记录装置及N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物对毛囊传入神经末梢的标记。（A）耳廓组织样本用于电生理实验的装置示意图，显示耳廓方向、神经位置、记录电极以及去除脂肪组织后暴露的毛囊神经支配区域。（B）在去除表层脂肪组织至真皮层的区域中，明场照明下可见多个毛囊。深色、通常呈双叶状的结构为皮脂腺。（C）B图方框区域的放大视图，显示通过机械刺激后，利用落射荧光显微镜观察到的、由苯乙烯染料N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物标记的两个梭形末梢。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		柔性、惰性、半透明的固态硅橡胶聚合物。
No. 3 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz 昆虫针	Fine Science Tools	26002-10	极细的针，用于将耳廓制备物牢固地固定在PDMS上，同时造成最小损伤。
交流差分前置放大器	Digitimer	Neurolog NL104A	放大传入的感觉神经电图信号。差分记录可最大限度减少外部电噪声和基线漂移。
高/低通滤波器	Digitimer	Neurolog NL125	通过降低外部电噪声来调节信号，确保最佳的信噪比。
动作电位触发器	Digitimer	Neurolog NL201	设定事件检测阈值并在示波器上显示，用以反映动作电位检测的有效性。
音频放大器 & 扬声器	Digitimer	Neurolog NL120S	在显微镜下调整机械刺激装置时，可用于实时监听感觉末梢是否产生电活动。
示波器	Digitimer	PM3380A	我们使用的是这一旧型号，但任何标准示波器均可满足需求。
压电陶瓷片	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	电生理学/计算机接口
压电陶瓷电源	自制		输出0-200V直流电压，驱动陶瓷片位移，并通过记录/刺激软件和计算机接口实现输出的电子化可调控制。我们使用Spike2软件和1401micro计算机接口。
电生理学软件	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	用于电生理记录、刺激及数据分析的软件。
实验室接口	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	连接放大器/滤波器与计算机的电生理接口，用于输入神经电图信号，并驱动压电陶瓷运动。
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	一种可逆地嵌入细胞膜外小叶的荧光膜探针，主要用于监测囊泡膜的内吞/外吐作用。
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	一种磺化β-环糊精衍生物，可螯合已暴露于膜上的FM1-43（& 其他苯乙烯基吡啶𬭩染料），从而降低背景荧光，使内化染料更清晰可见。
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		单色、制冷CCD相机——基础型号
Volocity 3D 图像分析软件	Perkin Elmer	Volocity 6.3	图像采集与分析软件。