细胞外记录神经元电活动 果蝇 中枢神经系统

摘要

来源：Swale, D. R., 等 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录 黑腹果蝇. J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了从黑腹果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）进行神经元活动的细胞外记录。将切断的中枢神经系统置于记录室中，记录下行神经的电活动，以确定其基础放电频率。随后引入测试剂，记录放电频率的变化，以判断该试剂的兴奋性或抑制性作用。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 解剖并制备幼虫黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统

注意： 幼虫中枢神经系统解剖的方法在 Hafer 和 Schedl 的研究中已有清晰图示，但这些已发表的方法会缩短对测量放电频率至关重要的下行神经元。本文另述一种解剖幼虫中枢神经系统的方法，可保留较长且完整的下行神经元。

1. 生理盐水配制。
   1. 按以下浓度（单位：mM）配制解剖与记录用生理盐水：157 NaCl，3 KCl，2 CaCl₂，4 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES）；用酸碱调节仪将pH值调至7.25。
2. 解剖幼虫期 Drosophila 中枢神经系统（CNS）。
   1. 从培养瓶中识别并取出一只处于三龄游走期的 Drosophila melanogaster 幼虫，放入200 µL生理盐水中（图1A）。
   2. 用一对精细镊子夹住口钩，再用另一对镊子夹住幼虫腹部（图1B）。
      注意：切勿对腹部施加过大压力，以免撕裂幼虫薄弱的角质层。
   3. 轻柔地朝不同方向拉开口钩与腹部，使幼虫尾部与头部区域分离，从而暴露其内脏组织（图1C）。
      注意：中枢神经系统将与气管和消化道交织在一起。不要将中枢神经系统从周围组织中剪离，以避免切断下行外周神经。
   4. 用镊子小心将中枢神经系统从消化道和气管中分离出来（图1D）。
   5. 如有必要，使用Vannas弹簧剪在大脑叶后方手动横切中枢神经系统，以破坏血脑屏障。
      注意：此操作应根据所用化学物质的理化性质决定。 图2A 中的红线为建议的横切位置，横切后保留完整的下行外周神经干如 图2B 所示。完成步骤1.2.5后，该中枢神经系统即可用于后续实验。

2. 细胞外记录 果蝇 中枢神经系统

1. 准备中枢神经系统（CNS）以进行记录。
   1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制玻璃微电极，使其电阻达到 5–15 mΩ。
   2. 将切断的中枢神经系统放入含有 200 µL 生理盐水的石蜡室中。用连接在接地导线上的鳄鱼夹夹住一根未涂层的昆虫针，并将该针插入盐水中以完成电路。
   3. 使用显微操作器，将电极对准切断的中枢神经系统的尾端。在接触外周神经干之前，通过调整采集/分析软件中的阈值水平来消除背景噪声的记录。
   4. 通过在注射器上施加轻微的负压，将任意可及的外周神经吸入吸电极中。
      注意： 基线放电频率与被吸入电极的神经元数量相关，神经元越多，电极电阻通常越高。
2. 开始记录中枢神经系统下行神经活动的细胞外信号。
   1. 启动数据采集软件开始记录，并监测基线放电频率。在采集基线放电率数据前，让放电速率稳定 5 分钟。
   2. 如果对照处理的放电模式不是类似于图3A所示的簇状放电模式，则应弃用该样本及记录。
      注意： 放电模式的改变提示中枢模式发生器活动异常或不稳定，可能影响神经功能。
   3. 5 分钟后，加入 200 µL 生理盐水+溶剂，使腔室总体积达到 400 µL，开始记录对照放电率。
   4. 在建立基线后（3–5 分钟），吸出 200 µL 盐水，并加入 200 µL 溶解于生理盐水中的实验药物。
      注意： 二甲基亚砜（DMSO）是脂溶性化合物的推荐溶剂，其终浓度不应超过 0.1% v/v。
   5. 按顺序依次施加药物浓度（从低到高），并对每个浓度记录一段特定时间（由研究者根据药物的化学性质确定）。在采集/分析软件中通过添加注释标记该药物施加的时间点，注释应包括药物名称和终浓度。
      注意： 解剖后 30–50 分钟内，中枢神经系统的放电活动会下降约 10–20%，因此应设置适当的未处理对照组，且药物处理时间不应超过此范围。

结果

图1：从三龄幼虫中切除中枢神经系统的操作方法。（A） 完整的幼虫浸没在200 µL生理盐水中。箭头指示用于分离体壁的口钩。（B） 用两对镊子分别夹住幼虫中部和口钩，开始分离体壁。（C） 通过施加轻微且持续的压力分离体壁，以暴露内脏组织。（D） 中枢神经系统清晰可见（白色箭头），有时与内脏组织缠绕在一起。比例尺分别对应A、B、C和D图，长度分别为1000 µm、750 µm、500 µm和200 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Drosophila melanogaster（品系 OR）	布卢明顿果蝇品系中心	2376
隔振台	Kinetic Systems	9200 系列
法拉第笼	Kinetic Systems	N/A
带臂式体视显微镜	Nikon	SMZ800N	可使用多种显微镜；带臂支架至关重要
交流/直流差分放大器	ADInstruments	AM3000H	可使用型号 1700 替代型号 3000
音频监测器	ADInstruments	AM3300
Hum Bug 噪声消除器	A-M Systems	726300
数据采集系统（PowerLab）	ADInstruments	PL3504	可使用多种 PowerLab 型号
Lab Chart Pro 软件	ADInstruments	N/A - 在线下载
光纤光源	Edmund Optics	89-740	可使用不同光源，但光纤光源适应性最强
显微操作器	World Precision Instruments	M325
微电极夹持器	World Precision Instruments	MEH715	不同型号均可接受
BNC 电缆	World Precision Instruments	根据尺寸不同而定
玻璃毛细管	World Precision Instruments	PG52151-4
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-1000	也可使用 Narashige PC-100
黑蜡	Carolina Biological Supply	974228
未镀层昆虫针，#2 号	Bioquip	1208S2
精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-03