利用微电极阵列监测脑片中癫痫发作诱导的神经电活动

摘要

来源：Panuccio, G.，等。利用与微电极阵列耦合的啮齿类动物脑片记录和调控癫痫样活动。J. Vis. Exp. (2018)

本方案涉及使用微电极阵列（MEA）记录暴露于致痫药物的脑片中的电活动。该操作包括将脑片置于MEA记录室中，施加电刺激以诱导人工癫痫发作，并分析所产生的信号。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 多电极阵列（MEA）装置的准备

注意： 在开始记录前15分钟启动。

1. 将剩余的4AP-ACSF（4-氨基吡啶人工脑脊液）转移至一个500 mL的锥形瓶中。
2. 将锥形瓶放置在MEA（微电极阵列）放大器上方的架子上，并使用管路使溶液持续流入一个60 mL的注射器中。调节锥形瓶与注射器的高度，使溶液以重力驱动的方式以1 mL/min的流速流动。
   注意： 合适的高度取决于管路的内径（ID）。对于内径为5/32英寸的管路，30 cm的高度已足够。
3. 开始用95% O₂/5% CO₂混合气体对锥形瓶和注射器中的4AP-ACSF进行鼓泡。
4. 让4AP-ACSF通过灌注管路流入烧杯，直至管路中无气泡；然后停止溶液流动。
5. 将MEA基底的加热元件连接至恒温器。将干燥的MEA芯片放入MEA放大器中，并固定放大器头部。使用塑料巴斯德移液管将4AP-ACSF转移至记录室的入口和外周储液池中。
6. 将加热套管固定在磁性支架上，并将其尖端插入记录室的入口端口。将磁性支架固定在MEA放大器头部的磁条上。将灌注管路连接至套管，并将套管连接至恒温器。
   注意： 加热套管应由斜面聚四氟乙烯（PTFE）管覆盖，以到达记录室入口端口，并减少其金属材料引起的噪声。当入口储液池被4AP-ACSF充分填充后，应看不到灌注系统滴落的液滴。
7. 将吸液针放入储液池中，并通过将其浸入ACSF中验证是否存在负压；检查是否有持续的低频吸力噪声。
   注意： 吸液针应放置在使4AP-ACSF刚好流经脑片表面的位置。可使用真空管线或低噪声真空泵。
8. 调节流量控制器，使流速为1 mL/min，并开始灌注。
   注意： 重力驱动灌注可消除由蠕动泵可能引起的噪声；若使用蠕动泵，则必须选用低噪声型号。
9. 当4AP-ACSF开始通过套管流动后，打开恒温器。将加热套管温度设为37 °C，MEA基底温度设为32 °C，以使记录室内温度达到32 - 34 °C。
   注意：警告！ 切勿在无溶液的情况下加热套管，否则可能导致不可逆损坏。应将套管温度设定高于记录温度（即 32 - 34 °C），以补偿设定值与加热套管尖端及记录室内实际温度之间的固有温度偏移。流速、环境温度和记录室体积均会影响记录溶液的温度。步骤1.9中报告的设置已针对所述方案和设备进行了优化。务必使用热电偶检测实际记录温度，并根据需要调整设置。切勿将MEA基底加热至34 °C以上，以避免脑片过热。
10. 将外部参比电极置于记录室入口储液池中。
    注意： 尽管MEA芯片配有内置参比电极，但定制的记录室会将其覆盖，因此必须使用外部参比电极。饱和KCl（氯化钾）电极颗粒最为实用，因其无需氯化处理即可直接使用。

2. 微电极阵列实时成像

1. 待4AP-ACSF液面和记录温度稳定至理想状态后，将灌流和吸引开关转至关闭位置，以暂时停止灌流和吸引。
   1. 使用倒置的玻璃巴斯德移液管，迅速将一片脑切片转移至MEA记录室中。根据需要，使用火焰抛光的卷口巴斯德移液管调整其在MEA记录区域上的位置。图1C）或柔软紧凑的刷子。放置固定锚（图1D) 放置在脑切片上。通过将两者的旋塞重新转回开启位置，恢复灌注和吸引。
      注意： 关键！ 切片转移及重新灌注应在60秒内完成，否则组织可能死亡。固定切片的压片锚应置于4AP-ACSF中，以避免因表面张力差异导致放置时脑片移动。用于将脑片固定在MEA上的压片锚可使用不锈钢丝和尼龙线自行制作（图1D）或从商业来源获得。 图1E 显示最终的实验装置，其中MEA芯片已连接至放大器的头部：脑切片置于记录室内的MEA芯片上，并由定制的锚具固定。参考电极（红色圆圈）和覆盖加热套管的聚四氟乙烯（PTFE）管路位于进液储液池中，而吸液针（蓝色箭头）则位于出液储液池中。
2. 使用安装在倒置显微镜载物台上的相机拍摄脑切片图像。
3. 运行脚本 mapMEA 在计算机软件上启动图形用户界面以映射电极。
   注意： 定制软件允许用户选择与脑切片特定结构相对应的电极。此步骤对于通过电刺激激活正确通路并抑制痫性活动至关重要。
4. 点击 浏览 单击按钮以加载脑切片图像。确保参考电极出现在MEA左侧上半部分的上排图 2A, 三角标记）。点击 激活指针 按钮，然后选择阵列最左侧一列的顶部和底部电极，以标记用于图像校正和电极定位的 XY 坐标。
5. 从 切片类型 下拉菜单选择 水平的. 勾选 默认结构 复选框
   注意： 可以通过选择来定制结构 输入新结构 按钮。水平脑切片的默认结构如图所示。 图2A.
6. 使用脑片图像下方的数字按钮，选择对应于感兴趣区域（ROI）的电极，然后点击结构面板中相应的按钮以进行分配图2B）；对每个 ROI 重复此步骤。
7. 按压 保存 按钮：软件将生成一个名为结果文件夹 #EXP_标记电极 包含一个报告所选电极和感兴趣区域（ROIs）的表格。

3. 癫痫样活动的记录与电学调控

1. 让脑片在记录室中稳定5 - 10分钟后再开始记录。
2. 在开始刺激程序前至少10分钟打开刺激单元，以使其完成自校准和稳定。启动刺激控制软件，并通过软件主面板上的绿色LED指示灯确认刺激器与MEA放大器已正确连接。
3. 采用双极配置设置刺激。选择与CA1区/近端下托的锥体细胞层接触的电极对。参见在已通过脚本映射的条目中，第24、25项 mapMEA (参见 第12节）。使用导线将所选电极中的一个连接至刺激器的负极插孔，另一个电极连接至同一刺激器通道的正极插孔。另取一根导线将刺激器的接地端与放大器的接地端相连。
4. 启动录音软件。要采集数据，请按下 播放 在记录软件主面板上点击按钮。至少记录4次发作期放电。
   注意： 2 kHz 的采样频率可在获得较好场电位分辨率的同时，最大限度地减少硬盘空间占用。5 分钟的记录文件约占 80 MB。可能需要更高的采样频率， 例如，用于记录刺激伪迹或多单位放电活动。若仅需观察场电位，请使用300 Hz的实时低通滤波器以消除多单位活动。
5. 确定刺激强度。
   1. 在刺激控制软件中，使用主面板设计一个持续时间为100 µs/相的方形双相正负电流脉冲。
      注意：警告！ 直流刺激需要平衡的电荷脉冲，以避免损坏设备。
   2. 运行一个 快速 输入/输出（I/O）测试以确定最佳刺激强度。通过在刺激控制软件的适当位置添加不短于5秒的脉冲间隔，以0.2 Hz或更低的频率施加步骤3.5.1中设计的刺激脉冲。在 脉冲幅度 输入初始脉冲振幅为 100 µA/相位，随后在每次试验中以 50 - 100 µA 的步长逐步增加，直至刺激能够稳定诱发旁海马皮层出现类痫样放电事件（通过记录软件显示的信号进行确认）。
6. 边缘系统癫痫发生的电调控
7. 设置刺激器以执行所需的刺激方案。使用在输入/输出（I/O）测试期间确定的刺激强度。
   注意： 诱发电位反应的失败率应≤20%。
8. 刺激停止后，通过记录至少4次痫性放电（同步骤3.4）来验证网络是否恢复至刺激前状态。

结果

图1：本实验方案所用的定制设备。（A）用于恢复、预加热和在4AP中预孵育的保持室，由烧杯和培养皿组装而成。培养皿的直径应小于烧杯，并通过注射器活塞固定位置。培养皿底部由尼龙网（来自柔软的丝袜）替代，并使用氰基丙烯酸酯胶水粘合在培养皿边缘。氧气通过插入培养皿与烧杯壁之间的弯形脊髓穿刺针（22 G）供给。气泡应从烧杯侧壁逸出，且不得接触尼龙网，以避免脑片移位。培养皿盖可用于覆盖顶部，防止人工脑脊液（ACSF）蒸发并维持氧饱和度。（B）定制记录室。In：进样口储液池，用于容纳加热套管和参比电极。Out：出样口储液池，用于容纳抽吸针头。Rec：记录室。（C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-D-赖氨酸	Sigma-Adrich	P7886	用于MEA包被
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	化学试剂
KCl	Sigma-Adrich	P9541	化学试剂
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	化学试剂
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	化学试剂
D-葡萄糖	Sigma-Adrich	RDD016	化学试剂
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761	化学试剂
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670	化学试剂
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	化学试剂
蔗糖	Sigma-Adrich	RDD023	化学试剂
丙酮酸，98%	Sigma-Adrich	107360	化学试剂
4-氨基吡啶	Sigma-Adrich	A78403	致惊厥药物
STG-2004	Multichannel System	STG4004-1.6mA	4通道刺激发生器，具有电压输出（±8 V）和电流输出（±1.6 mA）
MEA1060	Multichannel System	N/A	MEA放大器
平面MEA	Multichannel System	60MEA500/30iR-Ti w/o ring	必须无环状结构，以便使用定制记录室
McRack	Multichannel System		记录软件
McStimulus II	Multichannel System		STG4004控制软件
TC02	Multichannel System	TC02	双通道恒温器
PH01	Multichannel System	PH01	加热灌流套管
MPH	Multichannel System	MPH	用于PH01和吸液针的磁性支架
Elastostil E43	Wacker	E43	弹性密封剂，用于将定制记录室固定在MEA上
MEA定制室	Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	定制记录室
Ag/AgCl电极，片状，1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	定制记录室的参比电极
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	酶清洁剂
MATLAB	The Mathworks		用于电极映射的编程环境
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	振动切片机
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl电极片，1.0 mm（E205），参比电极