导航行为 果蝇 幼虫对嗅觉感觉神经元光遗传学刺激的反应

摘要

来源：Clark, D. A.等 追踪 黑腹果蝇 光遗传学刺激嗅觉神经元对幼虫行为的影响 J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了一项关于导航行为的研究 果蝇 幼虫在嗅觉感觉神经元（ORNs）光遗传学刺激下的反应。转基因 果蝇 在行为实验装置内的琼脂糖上放置表达有光敏感离子通道的幼虫。通过光遗传学刺激光照打开离子通道，引起阳离子内流，从而触发信号向大脑的传递，并记录其导航行为。

方案

1. 构建行为实验装置并准备用于行为实验装置中光遗传学刺激的硬件

1. 为构建一个避光行为实验箱，制作一个尺寸为89 x 61 x 66 cm的箱子³ （长35英寸 × 宽24英寸 × 高26英寸），由黑色有机玻璃亚克力板（厚3 mm）制成（参见 材料清单）。用于制作该盒子的材料在当地五金店应可购得。将此盒子放置于行为实验室内的一张桌面上（图 1A).
2. 安装一个配备红外长通830 nm滤光片和8 mm F1.4 C接口镜头的单色通用串行总线（USB）3.0电荷耦合器件（CCD）相机（参见 材料表) 固定在黑色盒子顶部中央。安装两条红外发光二极管（LED）灯带（参见 材料表) 放置在桌面上，以在黑暗的实验区域内照亮幼虫（图1A).
3. 构建LED平台时，取一块22 cm × 22 cm的方形铝板（建议喷涂哑光黑色漆以消除任何反射）。在铝板中央，使用金属切割工具切割一个足够大的孔，以便围绕CCD相机安装。
4. 用红色LED灯带覆盖金属板（参见 材料表）。将LED灯带电线串联焊接，并将灯带电线接入由树莓派2B微处理器控制的光耦继电器（参见 材料列表) (图1B 和 2).
5. 在将光电耦合继电器连接到LED灯带之前，先在树莓派处理器上安装并配置基于Ubuntu Mate/Raspbian Jesse/Linux的操作系统。连接电源以为LED灯带和光电耦合器供电图2）（参见 材料表）。将LED平台安装在CCD相机周围（图1B).
   注意： Ubuntu Mate v16.04 操作系统可免费获取。一组基于 Python 的简单命令可轻松用于编程控制 LED 光刺激模式（参见语法文件）。
6. 确保行为实验区域各位置的辐照度均匀。使用光谱仪测量实验区域表面的绝对辐照度，并将其确定为约1.3 W/m²。² 在整个实验区域的表面。
   注意： 在此强度下，实验过程中未观察到温度发生显著变化。另一项研究采用了约1.9 W/m²的较高辐照度² 在实验过程中未观察到温度变化。

2. 准备 果蝇 用于行为分析的幼虫

1. 将果蝇饲养在标准果蝇培养基上（见材料表），饲养条件为 25 °C、相对湿度 50–60%（RH），以及 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期。
2. 为了在单对嗅觉受体神经元（ORNs）中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 品系的处女雌蝇与 OrX-Gal4 品系的雄蝇杂交（“X”对应 21 个幼虫期气味受体（Or）基因中的一个，每个基因特异性地表达于 21 对 ORN 中的一对）。
   1. 或者，为了在全部 21 对幼虫期 ORN 中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 品系的处女雌蝇与 Orco-Gal4 品系的雄蝇杂交（“Orco”是所有 21 对 ORN 中均表达的共受体）。
   2. 在这些实验中，单独使用 UAS-IVS-CsChrimson 品系作为对照。
      注意：本处列出的果蝇品系均可从布卢明顿果蝇品系中心获取（见材料表）。
3. 当杂交中的雄蝇和雌蝇交配并产卵 48 小时后，将成虫转移至新的培养管中。
   1. 向含有卵的培养管食物表面加入 400 µL 混合液，该混合液包含溶解于二甲基亚砜（DMSO）中的 400 µM 全反式视黄醛（ATR）以及溶解于蒸馏水中的 89 mM 蔗糖。
      注意：少量蔗糖有助于幼虫摄食 ATR 溶液。ATR 是上调 CsChrimson 表达所需的辅因子，且对光敏感。
   2. 向含卵的培养管中加入 ATR 后，将培养管置于黑暗环境中继续孵育 72 小时。
      ​注意：尽管本研究及前述两项研究均未观察到 ATR 喂养对幼虫行为产生影响，但仍建议通过让测试品系摄入不含 ATR 的上述混合液（等量）来控制 ATR 喂养可能带来的影响。
4. 使用高密度（15%）蔗糖溶液将三龄幼虫（约在产卵后 120 小时）从果蝇培养基表面漂浮分离出来。用 P1000 微量移液器将漂浮在蔗糖溶液表面的幼虫转移至 1000 mL 玻璃烧杯中。
5. 每次用 800 mL 新鲜蒸馏水更换清洗幼虫，共清洗 3–4 次。在进行行为实验前，让幼虫静置 10 分钟。

3. 行为学实验

1. 保持行为实验室内温度恒定（22–25 °C）和湿度恒定（50–60% RH）。
2. 通过将150 mL融化后的琼脂糖（1.5%）倒入一个22 cm × 22 cm的方形培养皿中来制备幼虫爬行培养基。每次实验需进行8–10次试验，每次试验使用一个培养皿。将琼脂糖在培养皿中静置1–2小时，使其完全凝固并冷却后再用于行为实验。​
   1. 将不超过20只准备好的三龄幼虫转移至培养皿中央（图1C）。用培养皿盖盖好，并将培养皿放置于CCD相机下的行为检测区域。
      注意：根据实验设计，行为检测通常持续3–5分钟。若实验中使用气味物质提供导向线索，已观察到所产生的气味梯度在约5分钟内保持稳定。不建议延长检测时间。在此时间段内，未观察到幼虫因脱水或长时间暴露于630 nm红光而产生不利影响。
3. 打开850 nm红外LED光源，以便在视频中观察幼虫。启动CCD相机以记录幼虫的运动轨迹。
4. 使用与Raspberry Pi处理器配套的软件，编程设定合适的红光刺激模式。
   注意：可轻松修改一组基于Python的简单命令，以编程控制LED光刺激的模式（参见语法文件）。

结果

图1：行为实验装置及幼虫爬行培养基。（A） 黑箱式行为实验装置的正面视图。打开的门显示箱内天花板上悬挂着一台CCD相机。（B） 围绕CCD相机安装的金属平台底面视图，平台上装有用于光遗传学刺激的红色LED灯条。（C） 实验所用幼虫爬行培养基的顶视图。在开始记录幼虫运动之前，将约20只清洗过的幼虫沿中心放置于一个22 cm × 22 cm、铺有1.5%琼脂糖的培养皿中。含有幼虫的培养皿被置于行为装置中央，位于CCD相机正下方，并夹在两根红外LED灯条之间，后者作为相机的光源。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于捕捉幼虫运动的摄像机
CCD 相机	Edmund Optics	106215
M52 至 M55 滤光片螺纹转接器	Edmund Optics	59-446
用于成像镜头的 2" 方形螺纹滤光片支架	Edmund Optics	59-445
RG-715，2" 方形长通滤光片	Edmund Optics	46-066
光遗传学装置的电子元件
Raspberry Pi 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
三通道可编程电源	newegg.com	9SIA3C62037092
八通道光耦继电器	amazon.com	6454319
630 nm 四排 LED 灯带	environmentallights.com	red3528-450-reel
850 nm LED 灯带	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-kit
软件
Ubuntu MATE v16.04	Nubuntu	https://github.com/yslo/nubuntu
其他物品
黑色亚克力有机玻璃	Home Depot	MC1184848bl
果蝇食物及其他试剂
Nutrifly 果蝇食物	Genesee Scientific	66-112
琼脂糖粉末	Genesee Scientific	20-102
22 cm × 22 cm 方形培养皿	VWR Inc.	25382-327
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097
全反式视黄醛	Sigma-Aldrich	R2500
果蝇品系
UAS-IVS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	55134
Orco-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	26818
Or42a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	9970
Or7a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	23907