小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触后电流抑制

摘要

来源：Thalhammer, A., 等 将光遗传学与人工微小RNA相结合以表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触电流抑制。CA3神经元被携带表达荧光报告蛋白、光激活膜通道以及可下调电压门控钙通道表达的微小RNA构建体的重组病毒载体感染。将脑片置于记录室中，并用记录电极对CA1神经元进行膜片钳记录后，使用光脉冲刺激光激活通道，引起离子内流并产生动作电位。由于CA3神经元中缺乏电压门控钙通道，神经递质释放受到抑制，从而导致与之突触连接的CA1神经元中兴奋性突触后电流被抑制。

方案

1. 利用光遗传学靶向刺激基因敲低神经元，在完整神经环路中评估突触前蛋白的作用

注意：以下实验方案要求操作者具备急性脑切片电生理记录的相关经验，并能够使用电生理记录设备。

1. 立体定向注射嵌合血清型1和2的重组腺相关病毒（rAAV1/2）至脑内。使用小鼠或大鼠脑立体定向图谱确定目标脑区的立体定向坐标。
   1. 使用微电极拉制仪制备具有长柄的显微注射微电极 Ø 7–9 µm；用剪刀剪断微注射移液管的管脚。使用细记号笔和坐标纸，在微注射移液管上每隔 2 mm 标记一个校准刻度。
   2. 使用异氟烷麻醉动物，并将其固定于立体定位仪中。
   3. 在整个手术过程中，使用设定为37℃的加热垫保持动物体温 °C.
   4. 使用眼用润滑剂保护眼睛。
   5. 使用电动剃须刀剃除头部的毛发。
   6. 用棉签将聚维酮碘涂抹于剃毛后的头部。
   7. 在解剖显微镜下，沿中线做一切口。
   8. 用棉签清洁颅骨表面，使前囟和后囟清晰可见。
   9. 将注射移液管放入其固定架中，将固定架连接到立体定位仪的机械臂上。
   10. 根据前囟和/或后囟确定注射位点的 x 和 y 坐标。
   11. 使用钻头对目标区域的颅骨进行减薄。
       注意： 使用轻柔的环形运动，避免钻穿颅骨，以免损伤脑表面。
   12. 如果有出血，用纸巾吸去多余的血液。
       注意： 过量的血液将难以准确确定 z 坐标。
   13. 加载 ≤2 µ通过毛细作用将病毒液体吸入注射微量移液器中。
   14. 将注射微移液管移至注射位点的 x 和 y 坐标位置。
   15. 根据硬脑膜计算 z 坐标，并缓慢将移液管插入脑组织。
   16. 当到达 z 坐标时，等待 3 min，以使组织适应。
   17. 使用1 mL注射器通过柔性管连接至注射微移液管后端，施加较低的正压。通过解剖显微镜观察病毒从注射微移液管中排出的速度，并以校准刻度为参考点进行监测。
       注意： 病毒注射需以缓慢速率进行（<100 nL/min）以避免组织损伤。
   18. 注射完成后，等待5分钟，将注射微管回撤0.2 mm，再等待5分钟，以避免病毒回流。
   19. 缓慢而彻底地将注射微量移液器从脑组织中撤出，并将其丢弃至装有漂白剂的容器中。
   20. 用生理溶液润湿颅骨，并用3-4针缝合皮肤。
   21. 将庆大霉素软膏涂抹于伤口处。
   22. 将动物单独饲养于清洁的笼具中，提供食物颗粒，并在加热灯下保温，直至其完全恢复。
2. 注射后至少15天，在深度异氟烷麻醉下断头处死动物。
3. 使用振动切片机，以通入气体（95% O₂₂，5% CO₂₂) 冰冷的人工脑脊液（aCSF）溶液，包含（单位：mM）：123 NaCl，1.25 KCl，1.25 KH₂PO₄，1.5 MgCl₂，1 CaCl₂，25 NaHCO₃₃，2 毫摩尔钠丙酮酸盐和 18 毫摩尔葡萄糖（渗透压调节至 300 mOsm）。例如，若目标是分析 CA3 至 CA1 锥体神经元的突触传递，则制备海马结构的矢状切片（350 µ微米厚。
   注意： 从这一步开始，需在低光照条件下操作，以避免环境光激活光遗传学探针。
4. 让切片在37℃下恢复30分钟 °将脑片置于专为保存脑片设计的切片室内的相同人工脑脊液（aCSF）中。在室温下将脑片保存在同一脑片室中，直至进行记录。
   注意： 在这些条件下，切片可保持健康状态长达6–8小时。
5. 将一片脑片转移至浸没式记录室，并以2 mL/min的速度灌流用于恢复的相同人工脑脊液（aCSF），其中添加1.5 mM CaCl₂₂ 总钙²⁺：2.5 mM）且不含丙酮酸钠。
   注意： 切片在低浓度 Ca 条件下制备并维持²⁺ （1 mM）以尽量减少毒性。记录在 2.5 mM Ca²⁺ 促进囊泡释放。
6. 简要检测表达的荧光报告基因的信号（例如TdTomato； 图1B以确定感染的定位和强度。
7. 用含有以下成分（单位：mM）的细胞内液填充膜片电极：110 K-葡萄糖酸盐、22 KCl、5 NaCl、0.5 乙二醇双（β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA），3 摩尔氯化镁（MgCl）₂，4 腺苷 5′-三磷酸镁盐（Mg-ATP），0.5 三磷酸鸟苷三钠盐（Na₃-GTP），20 K₂-磷酸肌酸，10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液（用KOH调节，HEPES-KOH，pH 7.28，290 mOsm）Ω).
   注意： 使用移液管电阻为5–6 m的膜片电极Ω.
8. 在红外光照下，对接受感染神经元突触输入的神经元建立紧密封接的全细胞记录。例如，如果感染了CA3锥体神经元，则对CA1区域近端至中段的锥体神经元进行膜片钳记录。图1C).
   注意： 串联电阻可以不进行补偿，但应保持恒定且较低（≤20 MΩ）Ω).
9. 使用药理学方法分离待研究的突触电流。例如，若旨在研究兴奋性突触传递，则用10 μM的拮抗剂阻断抑制性突触传递 µM bicuculline
10. 使用与光纤耦合的473 nm蓝光激光器诱发突触电流，例如兴奋性突触后电流（EPSCs）Ø ≤250 µm) 定位于感染神经元的胞体上（例如CA3锥体神经元
    1. 将刺激时长调整至最短，以降低每次光脉冲诱发多个动作电位的可能性。若使用ChETA，应设置为2 ms。
    2. 调节激光刺激强度，以产生微弱但可清晰检测的突触电流（在-70 mV钳制电位下记录CA3与CA1锥体神经元之间的兴奋性突触电流，其峰值幅度≤50 pA）； 图1D）。如果使用ChETA和250 µm的光纤 µ直径为 m 时，光纤出口处的刺激强度应为 1–3 mW。
       注意： 如果无法调节激光强度，请使用中性密度滤光片。
    3. 将473 nm激光照射在感染神经元的胞体上，避免照射其轴突。例如，将光照射在CA3区的胞体上，避开Schaffer侧支，以防止轴突的直接去极化。
    4. 应用河豚毒素（TTX；0.5 µM），一种钠通道阻断剂，以确认这些通道由动作电位驱动。
    5. 在不同的记录中，对所研究的突触电流施加选择性阻断剂，以确认刺激具有选择性。
       注意： 例如，加入2,3-二氧代-6-硝基-7-磺酰胺基-苯并[f]喹喔啉（NBQX，10 µM）至 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）型谷氨酸受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）。
    6. 在相同的急性脑片中，比较光学和电学刺激在重复刺激（≥2次刺激，≤20 Hz）下诱发的突触电流。当使用对照微小RNA（miR）时，电刺激与光刺激应表现出相似程度的突触易化或抑制，表明两种刺激方式激活了相似的细胞机制。
       注意： 上述步骤对于确保光刺激不会引起突触前末梢的直接去极化至关重要，从而避免绕过某些突触传递机制。

结果

图1. 评估Ca在其中的作用_v2.1[EFa] 和 Ca_v2.1 通过光遗传学靶向刺激敲低神经元，在天然海马体中检测 EFb。 （A） 用于rAAV载体的表达盒示意图 在体 感染 （B） 海马切片显示 TdTomato 荧光仅限于 CA3 区域及其投射纤维。 (C) 实验配置：将激光束照射至CA3锥体细胞胞体，同时对CA1锥体神经元进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑切片预室	哈佛仪器	BSC-PC
基于CCD相机的成像仪	伯乐（Bio-Rad）	ChemiDoc™ MP
细胞培养试剂	Life Technologies
钻孔	Foredom	K.1030
EGTA	Sigma	E4378
庆大霉素软膏	本地药房
葡萄糖	Sigma	G7021
HEPES	Sigma	54459
注射微移液管	Narishige	GD1
无机盐 & 去垢剂	Sigma
K2-磷酸肌酸	Calbiochem	237911
KGluconate	Fluka	60245
激光	Laserglow Technologies	LRS-0473-GFM-00100-03
膜	Amersham	Protran™ 0.2 µm NC
MgATP	Sigma	A9187
微量移液器架	Narishige	IM-H1
微量移液器拉制仪	Narishige	PC-100
Na3GTP	Sigma	G8877
NaPyruvate	Sigma	P5280
眼部润滑剂	本地药房	Lacrigel
聚维酮碘	本地药房	聚维酮碘
立体定向仪	WPI
河豚毒素	Tocris	1069	有毒的
Vibratome	Leica	VT1200S