小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触后电流抑制

摘要

来源：Thalhammer, A., 等 将光遗传学与人工微小RNA相结合以表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触电流抑制。CA3神经元被携带表达荧光报告蛋白、光激活膜通道以及可下调电压门控钙通道表达的微小RNA构建体的重组病毒载体感染。将脑片置于记录室中，并用记录电极对CA1神经元进行膜片钳记录后，使用光脉冲刺激光激活通道，引起离子内流并产生动作电位。由于CA3神经元中缺乏电压门控钙通道，神经递质释放受到抑制，从而导致与之突触连接的CA1神经元中兴奋性突触后电流被抑制。

方案

1. 利用光遗传学靶向刺激基因敲低神经元，在完整神经环路中评估突触前蛋白的作用

注意：以下实验方案要求操作者具备急性脑切片电生理记录的相关经验，并能够使用电生理记录设备。

1. 立体定向注射嵌合血清型1和2的重组腺相关病毒（rAAV1/2）至脑内。使用小鼠或大鼠脑立体定向图谱确定目标脑区的立体定向坐标。
   1. 使用微电极拉制仪制备具有长柄的显微注射微电极 Ø 7–9 µm；用剪刀剪断微注射移液管的管脚。使用细记号笔和坐标纸，在微注射移液管上每隔 2 mm 标记一个校准刻度。
   2. 使用异氟烷麻醉动物，并将其固定于立体定位仪中。
   3. 在整个手术过程中，使用设定为37℃的加热垫保持动物体温 °C.
   4. 使用眼用润滑剂保护眼睛。
   5. 使用电动剃须刀剃除头部的毛发。
   6. 用棉签将聚维酮碘涂抹于剃毛后的头部。
   7. 在解剖显微镜下，沿中线做一切口。
   8. 用棉签清洁颅骨表面，使前囟和后囟清晰可见。
   9. 将注射移液管放入其固定架中，将固定架连接到立体定位仪的机械臂上。
   10. 根据前囟和/或后囟确定注射位点的 x 和 y 坐标。
   11. 使用钻头对目标区域的颅骨进行减薄。
       

结果

图1. 评估Ca在其中的作用_v2.1[EFa] 和 Ca_v2.1 通过光遗传学靶向刺激敲低神经元，在天然海马体中检测 EFb。 （A） 用于rAAV载体的表达盒示意图 在体 感染 （B） 海马切片显示 TdTomato 荧光仅限于 CA3 区域及其投射纤维。 (C) 实验配置：将激光束照射至CA3锥体细胞胞体，同时对CA1锥体神经元进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑切片预室	哈佛仪器	BSC-PC
基于CCD相机的成像仪	伯乐（Bio-Rad）	ChemiDoc™ MP
细胞培养试剂	Life Technologies
钻孔	Foredom	K.1030
EGTA	Sigma	E4378
庆大霉素软膏	本地药房
葡萄糖	Sigma	G7021
HEPES	Sigma	54459
注射微移液管	Narishige	GD1
无机盐 & 去垢剂	Sigma
K2-磷酸肌酸	Calbiochem	237911
KGluconate	Fluka	60245
激光	Laserglow Technologies	LRS-0473-GFM-00100-03
膜	Amersham	Protran™ 0.2 µm NC
MgATP	Sigma	A9187
微量移液器架	Narishige	IM-H1
微量移液器拉制仪	Narishige	PC-100
Na3GTP	Sigma	G8877
NaPyruvate	Sigma	P5280
眼部润滑剂	本地药房	Lacrigel
聚维酮碘	本地药房	聚维酮碘
立体定向仪	WPI
河豚毒素	Tocris	1069	有毒的
Vibratome	Leica	VT1200S