长时间孵育后小鼠脑切片中神经活动的测量

本文内容

摘要

本视频展示了一种利用钙成像和电生理记录技术测量小鼠脑切片中神经元活动的方法。通过用钾离子灌注组织，并借助高速数字成像记录细胞内钙离子变化，该方法可揭示神经元的实时反应。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 钙染料负载

根据研究人员的个人偏好选择钙离子染料。此处我们使用 Fluo-8AM 或 Fluo-4AM。但该方法也可适用于其他染料：将钙离子染料溶解于 DMSO 中，配制成 1 mM 的溶液，并加入 1% 的嵌段共聚物（例如，普朗尼克酸-127），最终体积为 50 µL，超声处理 10 分钟。
将上述溶液加入 aCSF 中，使染料终浓度为 10 µM，嵌段共聚物为 0.01%，用于脑片染色。
1. 对于成年动物（>12 周龄），直接将染料溶液（50 µL）滴加至脑片上，并维持 75 分钟，以促进染料更好地渗透至深层组织。
2. 为确保脑片在染色孵育期间充分供氧，准备一个带密封盖的玻璃加载室（直径 2.5 cm，高 3.5 cm 的圆形罐），其中将钙离子染料稀释于 2.5 mL aCSF 中。持续通入 95% O₂/5% CO₂ 混合气体，但不要鼓泡。
染料加载完成后，用 aCSF 洗涤组织，然后将其转移至孵育系统中，缓慢降温至 15 - 16 °C，直至准备用于实验。

2. 电生理记录与成像

将组织置于显微镜下的浸没式记录 chamber 中，并以含氧人工脑脊液（aCSF）以每分钟 4 - 5 mL 的流速灌流，温度可选择室温（~22 °C）或生理温度（~35 °C）。使用自制的“竖琴”固定组织，该装置由尼龙丝或金丝拉伸并粘合在 U 形金或铂丝上制成。
用于电生理记录：
1. 使用微电极拉制仪，从 1.5 mm（1.19 mm 内径）的硼硅酸盐玻璃毛细管制备记录电极，使其最终电阻为 5-6 MΩ。
2. 向电极内充入 3 - 4 µL 内液，并通过 CCD 相机在红外差分干涉对比（IR-DIC）下观察细胞。细胞内液的成分应根据具体实验目的进行精确优化，以实现预期的实验结果。
3. 使用显微操作器将电极移至细胞膜表面，同时通过电极夹上的吸力接口施加正压。由于视网膜内界膜（ILM）已被去除，无需预先刮擦膜表面。当电极接触细胞后，施加轻柔的负压以形成吉欧姆（gigaohm）密封，随后施加短暂的负压以破裂细胞膜。
4. 根据需要，采用标准技术进行全细胞电流钳或电压钳记录。
钙成像：
1. 对于 Fluo-4 的单波长激发，激发光通过 460 - 490 nm 带通滤光片，发射光通过 515 - 550 nm 带通滤光片。使用高速数字相机以实现最快且最灵敏的信号采集。根据需要采集图像。
2. 测量 Fluo-4 在单一激发波长下荧光强度随时间的变化。

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材料

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