长时间孵育后测量小鼠脑切片中的神经活动

摘要

来源:Cameron， MA 等人，用于电生理学和钙成像的急性神经元组织的长时间孵育。J. Vis. Exp. （120）、（2017 年）

该视频演示了一种使用钙成像和电生理记录测量小鼠脑切片中神经元活动的技术。通过用钾离子灌注组织并通过高速数字成像记录细胞内钙变化，该方法揭示了实时神经元反应。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 钙染料负载

1. 根据研究人员个人的偏好选择钙染料。这里我们使用 Fluo-8AM 或 Fluo-4AM。然而，这种方法也可以应用于其他染料:将钙染料溶解在 DMSO 中，溶于 1 mM 溶液和 1% 嵌段共聚物（例如，pluronic acid-127）至最终体积为 50 μL，并超声处理 10 分钟。
2. 向 aCSF 中加入溶液，最终浓度为 10 μM，用于脑切片的 0.01% 嵌段共聚物。
   1. 对于成年动物（>12 周），将染料 （50 μL） 直接移液到脑切片上，并保持 75 分钟，以使染料更好地渗透到深层。
   2. 为确保在染料孵育过程中浸没切片充分充氧，请准备一个带有密闭盖子的玻璃加载室（直径 2.5 厘米、3.5 厘米高的圆形罐），其中装有在 2.5 mL aCSF 中稀释的钙染料。用 95% O₂/5% CO₂ 连续充氧。不要冒泡。
3. 染料上样后，用 aCSF 洗涤组织并将其转移到孵育系统中，缓慢将温度降至 15 - 16 °C，直到准备好用于实验。

2. 电生理记录和成像

1. 将组织置于显微镜下的浸没式记录室中，在 RT （~22 °C） 或生理温度 （~35 °C） 下以 4 - 5 mL/min 的流速灌注含氧 aCSF。使用定制的"竖琴"将组织固定到位，竖琴由尼龙或金线制成，拉伸并粘合在 U 形金丝或铂丝上。
2. 对于电生理学:
   1. 使用微量移液器拉拔器从 1.5 毫米（1.19 毫米内径）硼硅酸盐玻璃中准备记录移液器，以达到 5-6 MΩ 的最终电阻。
   2. 用 3 - 4 μL 内部溶液填充移液器，并使用 CCD 相机在红外微分干涉对比 （IR-DIC） 下观察细胞。应根据每个实验仔细定制细胞内溶液，以实现实验结果。
   3. 使用显微作器定位移液器，同时保持通过吸液口施加在细胞膜上的移液器支架上的正压。由于 ILM 已从视网膜中取出，因此不需要事先刮擦膜。移液器放在池上后，对移液器施加轻微的负压以实现千兆级密封。然后，用少量负压破坏细胞膜。
   4. 根据需要使用标准技术进行全电池电流钳或电压钳记录。
3. 钙成像:
   1. 对于 Fluo-4 的单个激发波长，通过 460 - 490 nm 带通滤光片滤光片滤光，并通过 515 - 550 nm 带通滤光片滤光片发射光。使用高速数码相机进行最快速、最灵敏的记录。根据需要获取图像。
   2. 在单个波长 （Fluo-4） 上测量荧光随时间的变化。

材料