利用河豚毒素和河豚毒素抗性钠通道检测单突触连接

摘要

来源：Zhang, X. 等，利用河豚毒素抗性钠通道检测果蝇中的单突触连接。视觉化实验杂志 (2018)

本视频演示了利用转基因果蝇测试单突触连接的方法。该果蝇的突触前神经元表达对河豚毒素不敏感的钠通道以及对红光敏感的通道蛋白，通过光遗传学手段激活这些通道，使突触前神经元兴奋并传递信号至突触后神经元。

方案

1. 准备果蝇并鉴定GAL4启动子品系

1. 选择一个GAL4启动子品系，并将其与携带UAS-NaChBac转基因以及用于激活的光遗传学转基因的果蝇进行杂交。
   注意：选用UAS-CsChrimson 是因为其具有高电导性，且易于激活河豚毒素（TTX）抗性钠通道（NaChBac）介导的动作电位。UAS-NaChBac和UAS-CsChrimson均可从Bloomington Stocks保种中心获得。
2. 将全反式视黄醛溶于乙醇中配制成35 mM的储存液，并于-20 °C冰箱中保存。
3. 取28 µL该储存液加入约5 mL复水的马铃薯片培养基中，混匀后铺入装有常规 Drosophila 培养基的试剂瓶顶部。
4. 将表达csChrimson的成年果蝇饲养在含有0.2 mM全反式视黄醛的食物中1–3天。

2. 准备TTX储备液

1. 用蒸馏水或去离子水配制 1 mM TTX 的储备液。将该溶液储存于实验室冰箱中，可保存数月。请查阅所在机构关于 TTX 储存的政策，因为许多机构将 TTX 划分为危险品或管制物质。

3. 准备果蝇用于电生理学实验

1. 收集饲养在含全反式视黄醛食物上的 1–3 日龄成年果蝇。
2. 将果蝇放入玻璃闪烁瓶中，并将瓶子置于冰上 1 分钟以使其 immobilize（固定）。
3. 使用粗镊子将一只果蝇插入定制的记录室。该记录室由一块厚度为 1/16 英寸的丙烯酸材料经激光切割成直径 3½ 英寸的圆形制成，在其中心切割出一个直径 ¾ 英寸的孔，孔中用双组分环氧树脂固定一片定制金属箔；该金属箔上有一个三角形小孔，用于插入果蝇。
4. 在果蝇周围涂抹石蜡或紫外（UV）固化环氧树脂，以牢固地将其固定在记录室内。
5. 使用可弯曲光导纤维通过体视显微镜对样品进行照明，以便观察。调节光导纤维的位置，使其从侧面斜向照射果蝇，实现斜向照明。
6. 将光照强度调节至仍能清晰观察果蝇的最低水平。该光强在不同实验之间可能有所变化。
   注意：本方案可通过采用 in situ 脑 外植方法进行调整。
7. 准备细胞外记录用灌流液。该灌流液（单位：mM）包含：103 氯化钠（NaCl）、3 氯化钾（KCl）、5 N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸、8 海藻糖、10 葡萄糖、26 碳酸氢钠（NaHCO₃）、1 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、1.5 氯化钙（CaCl₂）和 4 氯化镁（MgCl₂） （调节至 270–275 mΩ）。灌流液用 95% O₂/5% CO₂ （碳合气）持续充气，并将 pH 值调节至 7.3。
8. 在果蝇样品上滴加 4–6 滴细胞外记录灌流液。此时可提高解剖显微镜的光照强度以获得更好的视野。
9. 通过电解法 sharpen（打磨）一根钨丝。制备时，先配制饱和硝酸钾（KNO₃） 溶液，然后在约 20 V 交流电（AC）条件下，将钨丝尖端浸入溶液中 20 次，每次 100 毫秒，直至尖端 sharpen（变尖锐）。使用 sharpen（打磨后）的钨丝去除果蝇头部的角质层，从而暴露脑组织。
10. 进一步去除包裹脑组织的气管和脂肪体以充分暴露脑。若需记录触角叶信号，可使用弯曲的钨丝或其他类似工具，将触角轻轻折入记录室金属箔下方，以提高视野清晰度。使用尖头镊子轻轻撕开目标记录区域表面的胶质鞘膜。
11. 将记录室转移至电生理实验装置。立即开始用经碳合气充气的细胞外记录灌流液进行灌流，以维持脑组织活性。灌流液储液瓶置于显微镜载物台上方，依靠重力向样品持续供液，并通过真空泵和 2 L 锥形瓶收集废液。

4. 获得全细胞记录

1. 使用商用移液管拉制仪制备膜片电极。参考说明书中的设置参数，以获得尖端电阻接近 7 mΩ 的合适电极。
2. 向膜片电极内加入 4 µL 胞内记录溶液。该胞内生理盐水溶液（单位：mM）包含 140 钾天冬氨酸、10 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 （HEPES）、4 镁腺苷三磷酸（MgATP）、0.5 三磷酸鸟苷三钠盐水合物（Na₃GTP）、1 乙二醇四乙酸（EGTA）和 1 氯化钾（KCl）。
3. 设置膜片钳放大器以进行全细胞记录。将放大器的偏移量归零，并设定放大器输出测试脉冲。此处使用 AM Systems 公司的 2,400 型膜片钳放大器。
4. 通过电极施加正压并接近细胞。使用显微操作器引导电极接触细胞。释放正压。将膜的保持电位设定为 -60 mV。当电极与细胞膜之间形成吉欧姆封接时，表现为微小的亚皮安级保持电流。
   注意：若使用绿色荧光蛋白（GFP）引导的细胞靶向，请尽量减少使用落射荧光照明，以避免 ChR2 激活及潜在的突触抑制。此外，在执行第 5 步前应等待数分钟。
5. 将放大器设置为从 -50 mV 到 -60 mV 输出测试脉冲。此设置为膜片钳放大器的标准配置。测试脉冲将显示一个较大的电容性瞬变，代表为充电膜片电极所需的电流。通过调节 AM 2400 或类似放大器上的电容补偿旋钮来消除电容性瞬变。
6. 施加短暂的负压脉冲以击穿细胞膜，获得全细胞构型。
   注意：当电容性瞬变显著增大，反映出神经元电容时，表明已形成全细胞构型。通常还可观察到保持电流（基线）轻微增加。将放大器切换至电流钳模式，并调节细胞电位至 -50 至 -60 mV。

5. 测试突触连接性

1. 配置数据采集（DAQ）系统，以触发光发射二极管（LED）驱动器产生光脉冲。此处使用 National Instruments DAQ 系统与 Matlab 向 LED 驱动器输出模拟信号。通过调节发送至驱动器的模拟信号来控制 LED 的光强。所用 LED 的波长为 620–630 nm。
2. 将高功率红色 LED 直接置于样本下方。调节光强，使照射到果蝇的光强达到 0.238 mW/mm² 。
3. 在记录目标突触后细胞的同时，激活突触前神经元。可通过光遗传学、药理遗传学或神经刺激实现细胞激活。此处应用 csChrimson 并施加短暂的红光脉冲。
   注意：突触连接可在电流钳模式下监测为兴奋性突触后 电位（EPSPs），或在电压钳模式下监测为兴奋性突触后 电流（EPSCs）。在施加河豚毒素（TTX）前，应对 40 ms 的光脉冲产生可观察到的突触反应。若未观察到连接，则表明这些神经元之间很可能不存在单突触或多个突触的连接。可根据需要调整钳制电位，以突出兴奋性或抑制性连接。
4. 若在正常生理盐水中观察到连接，则向灌流系统中加入 TTX，使其终浓度达到 1 µM。使用循环泵收集并重复利用生理盐水，以节约 TTX。蠕动泵将从浴槽中吸取盐溶液并将其返回至盐水储液罐。
5. 调节泵速，以提供稳定而较强的负压，防止浴槽内盐水液面波动。
   注意：施加 TTX 后，应导致全细胞记录中神经元的动作电位活动停止。这表明盐水中已加入足量的 TTX。
6. 再次施加短暂的红光脉冲（每次脉冲持续 40 ms）。此时，任何仍存在的突触连接很可能为单突触连接。 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
UAS-csChrimson	Bloomington 果蝇品系中心	55135	用作神经元激活工具
UAS-NaChBac	Bloomington 果蝇品系中心	9466	在河豚毒素（TTX）存在下恢复细胞兴奋性
河豚毒素（Tetrodotoxin）	Tochris	1078	购买河豚毒素可能需要特殊许可，因其属于管制物质
全反式视黄醛（all trans-Retinal）	Sigma-Aldrich	R2500	视蛋白通道的必需辅因子
可焊接 321 不锈钢 薄板， 厚度 0.002 英寸， 宽度 10 英寸	McMaster Carr	3254K7	用于制作定制果蝇固定装置。定制箔片可使用提供的 PDF 文件在 pololu.com 进行激光切割
解剖显微镜	蔡司（Zeiss）	Stemi 2000-C	用于制备样品的解剖操作
电热蜡笔（Waxer）	Almore	Eectra Waxer 66000	解剖过程中用于将果蝇固定在箔片上
石蜡（Paraffin Wax）	Joann	4917217	与电热蜡笔配合使用
5 号镊子（Number 5 forceps）	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	#5CO	用于解剖和去鞘操作
解剖剪刀（Dissection Scissors）	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	15001-08	用于解剖过程中去除部分体壁组织
钨丝（Tungsten wire）	A-M Systems	797500	通过电解处理制备锋利的解剖针具
循环式蠕动泵（Recirculating Peristaltic Pump）	Simply Pumps（Amazon）	PM200S	用于循环河豚毒素（TTX）溶液
蠕动泵调速控制器（Speed Controller for peristaltic pump）	Zitrades（Amazon）	N/A	PWM 调光控制器，适用于 LED 灯或灯带，12 伏特 8 安培，可调亮度开关调光器，DC12V 8A 96W，适用于 LED 灯条
Versa-Mount 精密压缩空气调节器	McMaster Carr	1804T1	用于封接过程中施加正压
玻璃毛细管（Glass capillaries）	世界精密仪器公司（World Precision Instruments）	TW150F-3	用于制作记录电极
多功能压力表（Multipurpose Gauge）	McMaster Carr	3846K431	用于压力调节器的压力监测
电生理摄像系统（Electrophysiology Camera）	Dage MTI	IR-1000	任何可在红外范围（850 nm）工作的摄像机均可使用。应避免使用红光照明，以免激活 csChrimson
红外 LED（IR LED）	Thorlabs	M850F2	用于斜向照明
红外 LED 光纤（Fiber optic for IR LED）	Thorlabs	M89L01	与红外 LED 耦合
物镜	奥林巴斯 40X	LUMPlanFLN	该物镜适用于大多数显微镜系统，对果蝇神经元的可视化效果良好
琥珀色 LED（Amber LED）	Thorlabs	M590L3d	用于观察 RFP 和 mCherry 荧光信号
蓝色 LED（Blue LED）	Thorlabs	M470L3d	用于观察 GFP 荧光信号
GFP 滤光片组（GFP filter set）	Chroma	49011	用于观察 GFP 荧光或激活 ChR2 视蛋白
定制 mCherry 滤光片组（Custom mCherry Filter Set）	Chroma	et580/25x 和 t600lpxr（来自 49306 滤光片组），但使用 et610lp 作为阻挡/发射光滤光片	仅在需要对表达 ChR2 视蛋白的特定神经元进行封接记录时使用
用于合并琥珀色与蓝色 LED 的二向色镜（Dichroic to combine Amber and blue LED）	Thorlabs	DMLP550R	仅在 mCherry 标记下进行封接，同时使用蓝光激活 ChR2 视蛋白
红色 LED（Red LED）	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	用于激活 csChrimson
LED 驱动器（LED Driver）	LEDSupply	3021-D-E-1000	用于驱动光遗传学刺激所需的 LED
微操纵器（Manipulator）	Sutter Instruments	MP-225	用于记录过程中精确定位电极
膜片钳放大器（Patchclamp Amplifier）	A-M Systems	Model 2400	使用功能相当的放大器亦可
贝塞尔滤波器（Bessel Filter）	Warner Instruments	LPF 202A	辅助滤波器，用于在封接过程中对电流信号进行滤波后送至示波器
数据采集系统	国家仪器公司（National Instruments）	NI PCIe-6321       781044-01	用于将放大器信号记录至计算机
BNC 接线端子模块 - BNC-2090A	国家仪器公司（National Instruments）	779556-01	用于连接放大器与数据采集卡
钢箔	McMaster Carr	3254K7	用于制作定制记录室的钢箔材料
磁铁	K&J Magnetics	D42	用于将记录室固定在铁架台上
1/16" 透明浇铸丙烯酸板	Pololu		用于制作定制记录室。丙烯酸板可使用提供的 PDF 文件在 pololu.com 进行激光切割