在大鼠模型中植入头戴式电极系统用于实时癫痫发作检测

摘要

来源：Kozák, G., 等. 大鼠的慢性经颅电刺激与皮层内记录. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了在麻醉大鼠体内植入头部电极系统以进行实时癫痫发作检测的方法。该操作包括放置刺激和记录电极，使用牙科水泥固定电极，并将其连接至安装在头部的放大器。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 刺激电极的制备

1. 制作一个刺激电极时，剪取六段长度为 10 cm 的微型连接导线，一端剥除 2 cm 绝缘层，另一端剥除 1 cm 绝缘层。
2. 将两根导线绞合在一起，并在较短的裸露端进行焊接。
3. 取一段包含三个封装单元的 SOT-353（小外形晶体管-353）集成电路带状封装条。
4. 将绞合后的导线穿过封装条上的三个孔，导线较长的裸露端应位于封装孔的空腔内。调整导线位置，使绝缘层末端与孔边缘对齐。
5. 在孔中填入牙科水泥以固定导线。
   注意：牙科水泥必须足够致密，以防止渗入封装空腔内。
6. 待水泥完全固化后（至少 10 分钟），翻转封装条，在孔上涂一层薄薄的瞬干胶，形成朝向多孔水泥的防水密封层。注意避免将裸露导线粘连在一起。
7. 在较短的裸露端将导线绞合后进行焊接（图 1A）。
8. 用精细镊子夹住导线较长的裸露部分，将其卷曲并缠绕嵌入空腔内（图 1B）。如有需要，可剪去多余导线。

2. 记录电极的制备

1. 制作一个记录用三电极（图1C-D），使用高速旋转锯切割一段长一厘米的不锈钢管。用锋利的针去除管端的毛刺，并确保管内无碎屑且完全通畅。
   注意：请勿使用镊子，以免导致管道变形。
2. 将一根长度不少于3 cm的镀金电路板间隔针弯成J形支架。将“J”形的长腿部分剪断后焊接，使其恢复原始形状，从而在长直部分（由立体定位仪夹持）与“U”形部分（用于固定电极并作为锚定点）之间形成可拆卸连接。将不锈钢管与“J”形支架的短腿部分粘合在一起。如有需要，可额外粘接一些1 cm长的支撑杆以增强稳定性。
3. 使用不锈钢超细剪刀剪取三段长度为2.5 cm的电极导线。确保切口清晰、锐利，且电极导线断面处的绝缘层保持完整。同时确保切割时施加的力未导致导线尖端弯曲。在每根导线的一端弯曲1至2 mm，角度各不相同（例如，一根保持直线，一根弯成45°，另一根弯成直角），以便区分。
4. 将导线插入管内。根据实验需求选择合适的电极间距（例如，用于皮层局部场电位（LFP）和电流源密度（CSD）记录时，建议导线尖端从管口伸出的长度分别为4.5 mm、4.1 mm和3.7 mm）。记录每根导线对应的深度，以确保通道顺序正确。
5. 当导线彼此紧邻并平行于管道时，使用细针在管道两端各滴一滴液体超级胶水以固定电极导线。确保胶水因毛细作用渗入管内，但不要流向伸出端的记录位点。
6. 准备一块带有合适微型连接器的电极接口板，该连接器需与所用记录系统兼容。
7. 将导线非记录端的弯曲部分插入电极接口板上对应目标记录通道的孔中。当所有导线就位后，用镊子将镀金插针推入孔内。
   注意：镀金插针可用牙科水泥固定，但在大多数情况下，即使不采取此安全措施也已足够稳定。

3. 麻醉

1. 将动物放入密封的麻醉诱导室中，以每分钟2升的医用空气输送4%至5%的异氟烷。
2. 当大鼠呈侧卧状态时，将其从诱导室中取出，并固定于立体定位仪上，连接合适的通气鼻罩。
3. 将异氟烷浓度调至2%，气流速率保持不变。检查麻醉深度：若夹捏足趾无回缩反射，则可继续操作；否则应加深麻醉。
4. 使用恒温监测系统将大鼠体温维持在37 ± 0.5 °C。在眼睛表面滴加石蜡油膏，防止角膜干燥。必要时，术中可重复此操作数次。
5. 皮下注射0.3 mg/kg的阿托品，以防止呼吸道黏液分泌。对于较长时间的手术，每四小时重复给药一次。密切监测呼吸情况，必要时调整蒸发器设置。

4. 刺激与记录电极的植入

注意：所有必要的手术器械均需进行高压灭菌，并在整个操作过程中严格遵守无菌和防感染的一般规则。避免接触手术区域以外的非无菌区域。电极在植入前需浸入70%乙醇中30分钟。

1. 使用理发推剪去除头皮上的大部分毛发。将脱毛膏涂抹于头皮，均匀铺开，静置数分钟。用刮板轻轻去除脱毛膏及残留毛发。先用清水冲洗皮肤，再用消毒剂冲洗。
2. 皮下注射1-2%利多卡因（总剂量不得超过7 mg/kg）以麻醉皮肤。眼部涂抹一滴兽用眼膏。例如，石蜡。
3. 用手术刀从额部至颈部沿正中线做一个彻底且较长（约2 cm）的矢状切口。分离包括骨膜在内的软组织，暴露颅骨。然后使用凿子或齿状镊子清理两侧颞骨嵴之间的区域。使用四个止血夹固定已分离的皮肤，以保持颅骨充分暴露。
4. 用精细镊子轻轻插入颞骨陡峭边缘与肌肉之间并将其分离。通过轻抖动作尽可能暴露颞骨的大面积表面，理想情况下从枕骨边缘至冠状缝平面，注意避免损伤肌肉。
5. 双侧颞部放置拉钩，以保持颞骨暴露。
6. 用1 - 2 mL 3%过氧化氢（H₂O₂）冲洗颅骨表面₂O₂），然后用 1 - 2 mL 水洗涤。
7. 非常小心地将颞骨表面风干，用眼科棉签吸去表面水分。测试刺激电极是否能贴合已清洁的颅骨垂直面（刺激电极的上边缘应与颞骨嵴的边缘对齐）。如有必要，重新调整止血钳和牵开器的位置，或用剪刀修整刺激电极的形状。
8. 用导电凝胶填充刺激电极的腔体，并在电极边缘涂上一层薄胶。
9. 将刺激电极一次性准确放置在颞骨干燥的表面，并用精细镊子牢固固定一分钟。确保胶水不与任何水分接触。如有必要，用眼科棉签吸干。
   警告： 如果电极变得不稳定，则将其移除。清洁骨骼后，使用新的刺激电极重复此步骤。
10. 将牙科水泥涂抹于刺激电极的边缘，同时使用眼科棉签持续吸干组织中渗出的水分。随后，用牙科水泥完全覆盖整个刺激电极。
11. 待水泥完全硬化后，在对侧重复上述步骤。
12. 在颅骨上钻多个孔以固定螺钉。将微型螺钉旋入孔中，并在其上覆盖牙科水泥。所用钻头直径应比螺钉直径约小10%。
13. 根据实验目的，可选择将连接器焊接到电缆末端，将其置于表面并用胶固定；或继续植入记录电极和光纤；或在颅骨上制备颅窗。若采用后一种方案，则仅在最后阶段焊接连接器并将其固定于装置上。如需长期同步进行经颅电刺激（TES）和局部场电位（LFP）记录，应植入上述电极三联体，而非单根导线。
    注意： 该装置可消除常见的共模刺激伪迹8。有关记录电极植入的详细步骤，请参见之前的实验方案。
14. 用消毒剂充分清洗暴露的组织。皮下注射1-2%利多卡因（总剂量不得超过7 mg/kg）。
15. 清创伤口边缘，并在连接器/植入物周围使用间断单纯缝合关闭伤口，然后用聚维酮碘对伤口进行消毒。
16. 皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。必要时可重复给药。
    注意： 可使用其他任何镇痛药物，需符合当地伦理审批委员会规定的要求。
17. 停止麻醉，松开耳杆和鼻夹，将动物放入术后恢复笼中使其苏醒。
18. 在术后最初几小时内需对动物进行密切监护。此后应定期检查植入部位。
    注意： 动物在恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。在动物完全从操作中恢复之前，应单独饲养。

结果

图1：刺激与记录电极制备步骤。（A）将绞合导线穿过孔洞并固定在封装体上，随后将剥皮后的导线缠绕填入腔体中；（B）刺激电极的最终形态；插图：封装体内缠绕的导线；（C）记录电极的侧视图；（D）记录电极的俯视图；插图：记录位点的尖端，间距为400 µm；（E）经颅刺激电极植入术中的实际图像。刺激电极已植入，同时部分固定螺钉也已安装到位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氰基丙烯酸酯液体	Henkel	Loctite 401
氰基丙烯酸酯凝胶	Henkel	Loctite 454
刺激电极用导线	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE 微型连接导线
板间隔器	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
连接器	E-tec Interconnect	P2510I-02
刺激电极的带状封装	Nexperia	74HC1G00GW	任何采用 SOT-353 封装的集成电路的带状封装均可使用
工业级 Grip Cement	Caulk Dentsply	675571（粉末）675572（溶剂）
导电凝胶	Rextra	ECG 凝胶
记录电极导线	California Fine Wire Co.	.002（50 微米）钨丝 99.95%（CFW 材料编号：100-211），HMl-天然，切成 3.0 英寸长段，圆形，切段导线
超细剪刀	Hammacher Instrumente	不锈钢 HSB 544-09
不锈钢管	Vita Needle Company	29 RW，304SS 管材，T.I.G. 焊接并带堵头
高速旋转锯	Dremel	型号 # 395
旋转锯支架	Dremel	型号 # 220
旋转锯切割轮	Dremel	型号 # 409
眼科棉签	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta 眼科棉签
湿性消毒剂	Egis	Betadine
干性消毒剂	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
钻孔机	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
固定螺钉	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS