在 Drosophila 幼虫神经肌肉接头记录突触电流

摘要

来源：Vasin, A., 等. 突触电流的局部大斑片记录 果蝇 幼虫神经肌肉接头 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了在果蝇幼虫神经肌肉接头处记录突触小体突触电流的技术。该技术能够监测单个突触小体的活动，对于研究具有增强的自发性或非同步突触活动的突变果蝇品系具有重要意义。

方案

1. 记录电极的制备

1. 拉制玻璃电极
   1. 使用以下程序设置微电极拉制仪（见材料表）：
      1. 第1行：加热510 拉制—速度30 时间250；第2行：加热490 拉制—速度30 时间250。
         注意：时间单位对应每单位0.5毫秒；其他单位为相对值。每次进行斜坡测试后，应针对每根灯丝调整加热值。
   2. 使用显微镜（35倍放大）检查拉制后电极的内径，确保其在7 – 10 µm范围内（图1A）。将毛细管储存于密闭容器中，防止灰尘积聚。
2. 火焰抛光
   1. 使用微加工仪（见材料表），以最大加热值的80 – 90%对毛细管进行火焰抛光（持续1 – 2秒）。确保抛光后电极的最终内径为5 µm（图1A）。
3. 弯曲电极
   注意：需进行两次弯曲，以便在高倍物镜下将电极置于肌肉上方。
   1. 使用图1B所示装置。将电极固定在操纵器上，并将尖端置于灯丝上方，但不接触灯丝。
   2. 将加热值设为最大值的60 – 70%，踩下微加工仪的脚踏开关持续1 – 2秒（见材料表）以加热灯丝。使用L形针轻轻下拉电极尖端（见图1B放大图），使弯曲角度约为90°（图1C）。
   3. 用镊子手持电极置于喷灯火焰上方，进行第二次弯曲，位置距离第一次弯曲处7 – 10 mm，弯曲角度约为120^°（图1C）。

2. 额外的准备工作

1. 配制类似血淋巴的溶液（HL3，单位为 mM）：70 毫摩尔氯化钠（NaCl）、5 毫摩尔氯化钾（KCl）、20 毫摩尔氯化镁（MgCl₂）、10 毫摩尔碳酸氢钠（NaHCO₃）、5 毫摩尔海藻糖、115 毫摩尔蔗糖、5 毫摩尔 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）以及 1 毫摩尔氯化钙（CaCl₂）；调节 pH 至 7.3–7.4。将溶液保存在冰箱中，并每周新鲜配制一次。
2. 刺激用移液管的制备方法与记录用玻璃移液管相同，但无需弯曲。
   注意： 刺激电极的制备方法在文献 28 和 27 中有详细描述。火焰抛光后的最终直径应在 5–7 µm 范围内。
3. 将一根刺激移液管插入与注射器相连的微电极夹持器中。

3. 兴奋性接头电流（EJCs）的电生理记录

1. 记录
   1. 将含有标本的培养皿放置在显微镜载物台上（图2）。将参考电极插入浴液中。
   2. 用HL3溶液填充记录电极。在10倍物镜下（见材料表），将电极浸入浴液，并使用显微操作器（见材料表）将其置于第2、3或4腹节的肌肉6和7上方（图3 A.1 和 A.2）。
   3. 切换至60倍物镜（见材料表）。使用落射荧光或微分干涉（DIC）光学系统对目标区域进行聚焦。将电极尖端置于突触小结顶部（图3 B.1–3）。
   4. 将电极极其轻柔地压向肌肉表面。过大的压力可能损伤神经肌肉接头（NMJ）或引起自发性突触活动增加。确保电极尖端未被堵塞——若已堵塞，应予以更换。
   5. 打开放大器、A/D转换板和计算机。
   6. 在放大器上选择电压钳模式。
   7. 启动数据采集软件，并选择“连续无间隙”（gap-free）记录模式。
   8. 在计算机屏幕上观察微型兴奋性接合电流（mEJCs）的出现。
   9. 确保mEJCs的幅度在0.2 – 0.7 nA范围内。
      注意：较小的EJCs提示记录电极存在缺陷或位置不当。
2. 刺激
   1. 在显微操作器控制下，通过视觉引导，将刺激电极置于支配第2–4腹节的轴突附近。
   2. 通过拉动连接电极夹持器的注射器活塞施加负压，使轴突被吸入电极内部（图2）。
   3. 打开刺激器。调节隔离单元上的旋钮（见材料表），先将电流设为零，然后缓慢增加电流，直至出现EJCs（或达到阈值）。
   4. 以高于阈值的强度进行刺激，刺激电流约为EJCs出现阈值电流的两倍。
      注意：根据我们的经验，该刺激强度最适宜避免动作电位失败或异常放电。例如，若在0.2 mA刺激电流下出现EJCs，则在整个实验过程中应使用0.4 mA的电流。

结果

图1. 微电极制备的最后步骤。 （A）拉制并火焰抛光后的电极尖端。 （B.1）尖端弯曲装置示意图。 （B.2）右侧为方框区域的放大图。电极与灯丝固定，使电极尖端位于金属丝上方略高处，且不与之接触。 （C.1）记录电极。 （C.2）右侧为方框区域的放大图。第一个弯折处的角度约为90°，第一个弯折处与电极尖端之间的距离约为1 mm。比例尺 = 3 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Microtorch 1WG61	Grainer	1WG61	微型火炬
Olympus BX61WI	Olympus	BX61WI	正置显微镜
Olympus Lumplan FL N 60x	Olympus	UPLFLN 60X	显微镜物镜 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Olympus	Uplanfl N 10X	显微镜物镜 10X
Narishige Micromanipulator	Narishige	MHW-3	三轴水压微操作器
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	电生理放大器
A.M.P.I Master 8	A.M.P.I.	Master 8	电刺激器
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex	刺激隔离器
TMC 抗振台	TMC	63-9090	抗振台
TMC 法拉第笼	TMC	81-333-90	法拉第笼
Digidata 1322A	Axon Instruments	Digidata 1322A	Digidata
计算机	Dell	Dell Dimension 5150	运行 Windows XP 操作系统的计算机
电极夹持器	WPI	MEH3SW	电极夹持器
光学滤光片	Omega optical	XF 115-2	用于绿色荧光蛋白（GFP）检测的滤光片组
pCLAMP 8	Axon Instruments	8.0.0.81	信号记录软件
Quantan	实验室内部软件	-	信号处理软件
Canton-S（野生型）	Bloomington 种质中心	64349	对照果蝇品系
cpx SH1	J.T. Littleton 惠赠	-	突触小泡融合蛋白 complexin 敲除果蝇品系，具有增强的自发胞吐作用
CD8-GFP	Bloomington 种质中心	5137	神经元表达荧光标记（GFP）的果蝇品系