用于研究脑切片中神经元的自动化图像引导膜片钳技术

摘要

来源：Wu, Q., 等. 应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑切片中的神经元. J. Vis. Exp. (2017)。

在本视频中，脑切片被固定在记录室中，使用计算机控制的显微镜定位并聚焦于目标细胞。随后，自动图像处理系统精确地将膜片钳电极移至细胞膜表面，形成封接，以监测电信号。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 系统设置

1. 构建压力控制单元。
   1. 根据电路图组装压力控制单元（图1）。根据电路原理图制造的印刷电路板（PCB）上焊接必要的部件（图1b）。使用标准电阻、发光二极管（LED）、金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）、电容器和连接器。将电磁阀焊接在印刷电路板（PCB）上。通过电线将气泵和气压传感器连接到印刷电路板。
      ​注意：在所有必要部件齐备后，压力控制单元的组装大约需要2小时。
2. 连接次级数据采集（DAQ）板卡。
   1. 将印刷电路板的数据输出连接到数据采集板，按照 表1.
      注意： DAQ板将运行于“单端模式”。端口映射见用户手册（参见 材料表).
   2. 将“AIn Pr S”连接至次级DAQ板上的一个模拟输入（AI）通道，将“R-Gr”连接至次级DAQ板上的一个模拟接地端。
   3. 将放大器的主输出端连接至次级数据采集板（DAQ）的一个AI通道，同时将接地端连接至该板的模拟地。
      注意：可使用标准 BNC 电缆连接放大器的主输出端。
   4. 剥去另一端的绝缘层，并连接正极信号（即 铜芯）连接至AI通道和接地端（即 将核心周围的细导线连接到模拟地。如果使用多个膜片钳通道，则对第二个通道重复此步骤。
      注意：稍后的步骤中将配置DAQ板的模拟输入。
   5. 将电源连接至次级数据采集板（DAQ板）的电源输出端。泵使用独立的12 V电源。
3. 连接管路。
   1. 连接气泵和两个阀门。
   2. 最后一步，使用三通连接器将来自阀门2顶部端口的软管与压力传感器和移液管支架连接。
   3. 若使用两支移液管，则在连接移液管固定器的管路上再添加一个三通连接器。在进行膜片钳记录时，手动切换正在使用的阀门和移液管。
4. 安装 Autopatcher IG。
   注意系统要求：Autopatcher IG 仅在运行 Windows 7 的 PC 上进行过测试，尚未验证适用于其他操作系统。所述操作步骤专门适用于材料表中所列的硬件。
   1. 从 GitHub 下载 Autopatcher-IG（https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG）。
   2. 安装 Python（参见 材料列表 （获取版本及下载地址）。
   3. 在命令行终端中输入“pip uninstall PyQt4”以卸载PyQt4库。
      注意： 该系统使用较旧版本的 PyQt4 库，以实现与 Qwt 和 Opencv 库的兼容。
   4. 从历史 wheel 文件（http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/）安装 Python 库。查找以下文件：Numpy（pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl）、Opencv（opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl）、Pyqt（PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl）和 Qwt（PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl）。
      1. 安装 wheel 文件时，进入保存文件的目录，输入“pip install ***wheelfilename***.whl”，并将“***wheelfilename***”替换为文件的实际名称。
         注意： 轮文件名中的“cp27”表示 Python 2.7，“win32”表示 Windows 32 位。如果“win32”不可用，请尝试“win64”。
   5. 为控制CCD（电荷耦合器件）相机，请下载并安装适用于64位系统的驱动程序（https://www.qimaging.com/support/software/）。然后下载适用于64位系统的MicroManager（https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release），以便在Python中控制相机。
   6. 为控制机械臂和显微镜载物台，请安装制造商提供的控制软件。
      注意： 通过此操作，控制操纵器所需的驱动程序也将被安装。安装包通常以光盘形式提供。
   7. 为控制辅助 DAQ 板，请安装随 DAQ 板购买时附带的 CD-ROM 中的 Universal Library。
5. 配置Autopatcher IG的硬件。
   1. 通过 USB 端口将显微镜载物台和操纵器控制器连接到计算机。
   2. 在“configuration”文件夹中的“ports.csv”配置文件中，按此顺序为设备分配COM端口号：设备0：显微镜载物台，设备1：左侧操作器，设备2：右侧操作器。保留ports.csv文件中的其他参数（即 “SCI” 和 “1” 保持不变。
      注意： COM端口编号信息可通过运行制造商提供的操纵器配置软件获取。进入“设置”选项卡，选择“设置”和“运动”页面，并查看顶部各选项卡的标签。或者，也可在PC设备管理器中找到该信息。
   3. 为中国台湾的 DAQ 板分配压力传感器以及封接通道 1 和 2（对应单元 1 和 2）的模拟输入通道编号。将通道编号输入“configuration”文件夹中的“DAQchannels.csv”文件。
      注意： 建议使用记事本应用程序而非电子表格程序打开 .csv 文件，因为使用电子表格保存更改时可能会修改文件信息。
6. 运行 Autopatcher IG。
   1. 打开放大器、显微镜控制器和操纵器控制器。确保放大器软件正在运行。
   2. 通过命令行终端使用 Python 运行 Autopatcher IG，操作步骤如下：首先，更改目录（大多数常用终端使用命令“cd”）至 Autopatcher IG 的安装路径，在命令行终端中输入“python Autopatcher_IG.pyw”，然后按“Enter”键。
      注意：在运行Autopatcher IG之前，请勿启动操纵器控制软件，否则将占用显微镜载物台和操纵器，导致Autopatcher IG无法识别硬件。若需控制其他模块，可在Autopatcher IG完全启动后运行操纵器控制软件。例如， 内联加热器）
7. 校准主移液器。
   1. 拉制膜片钳电极。将拉制好的玻璃电极用内液填充，并装载到显微操作器的电极夹持器上。
      ​注意：空的玻璃移液管在显微镜下具有不同的对比度，可能导致校准不准确。
   2. 将移液管尖端移至显微镜视野内并调至清晰。若使用拨号盘移动操纵器和/或显微镜载物台，请按下键盘上的“z”键更新坐标。
      注意： 如果使用键盘（显微镜载物台：A/D 对应 x 轴，W/S 对应 y 轴，R/F 对应 z 轴；操纵器：H/K 对应 x 轴，U/J 对应 y 轴，O/L 对应 z 轴，1/2 对应单元编号）控制移动，则无需执行此操作，因为坐标将实时更新。
   3. 在主图形用户界面（GUI）上，点击已安装移液器的对应单元的“开始校准”按钮图2).
      注意： 校准完成后，将弹出一个窗口。
      注意校准将自动进行，大约需要3.5分钟。点击同一按钮（校准开始后该按钮会切换为“取消校准”）可中止校准过程。
   4. 通过点击主图形用户界面底部的“保存校准”来保存校准参数（该操作将保存两个操纵器的当前校准状态，供将来加载使用）。
      注意在低倍（4或10倍）和高倍（40倍）放大下，视场必须对齐，以确保二次校准正常工作。请参考所用光学系统用户手册中的对齐操作步骤。
      

2. 自动化膜片钳实验步骤

1. 制备急性脑切片
2. 准备用于膜片钳的玻璃移液管。
3. 将一片脑切片置于记录室中央。使用切片固定装置或“琴弦式固定器”稳定切片。
4. 检测荧光细胞。
   1. 在4倍物镜下找到目标区域。通过开启点击移动（“CTM”）模式并点击目标区域中心来移动显微镜载物台。或者，使用键盘移动显微镜载物台（A/D - x轴，W/S - y轴，R/F - z轴）。
   2. 切换至高倍镜，通过数字键盘上的 R/F 键沿 z 轴方向移动显微镜来调节焦距。
      注意建议调整水浴液面高度，使在低倍和高倍物镜下观察时，z轴方向的焦平面相同或相近。
   3. 点击主图形用户界面（GUI）列“Unit 0”中的“Detect Cell”按钮。如果实验装置的LED或激光光源无法通过TTL信号控制，请手动打开LED/激光；细胞检测完成后将弹出提示窗口。
      1. 必要时关闭LED/激光器；“Memory positions”图形用户界面中将显示细胞坐标的列表。通过点击坐标旁的“X”按钮，从列表中删除不需要的细胞。
      2. 或者，如果靶细胞未进行荧光标记，请在主图形用户界面（GUI）上点击“Mouse mode”。点击目标细胞，细胞上将出现一个带数字的黄色圆点，该细胞的坐标将显示在“Memory positions”图形用户界面中。
5. 校准辅助移液器。
   1. 用内液填充玻璃移液管的三分之一。将移液管装入连接在显微操作仪上的移液管持握器中。
   2. 使用低倍物镜。将移液管移入视野，并通过键盘调整焦距（H/K - x轴，U/J - y轴，O/L - z轴）。使用“1”和“2”在单元1与单元2之间切换。
   3. 单击“加载校准”以加载主校准。在主图形用户界面中，单击正在使用的单元下方的“次级校准”按钮。例如，如果使用的是单元2，则单击“单元2”列中的“次级校准”按钮。按照弹出窗口的指示切换到高倍镜。
6. 封接目标细胞。
   1. 确保“MultiClamp”（即 放大器）软件正在运行。单击“Patch control”按钮以打开“Patch control”图形用户界面；此界面可能需要几分钟时间才能打开。
   2. 在主图形用户界面“Unit 0”列中勾选“40X”，使用40倍放大倍率的物镜。在“Memory position”图形用户界面的坐标列表中，点击目标细胞所在行旁边的“go to”按钮，显微镜将自动移动至该细胞位置。
   3. 在主图形用户界面中，点击正在使用的单元的CTM按钮，以启用鼠标点击后的移动功能。点击目标细胞，移液管尖端将移动至该细胞。
   4. 单击“Patch控制”图形用户界面中的“Patch”按钮。
      注意： 自动封接将开始，可在“封接控制”图形用户界面中监测压力和阻抗。
      1. 使用“选择单元1”按钮在两个单元之间切换输入信号。
         ​注意： 该系统将接近目标细胞，施加负压，匹配细胞膜电位，并根据一系列压力和电阻阈值及逻辑判断来检测吉欧封接（gigaseal）的形成。
      2. 在“Patch control”图形用户界面中，通过点击相应的按钮，可在任意时刻操控自动流程。例如，再次点击“Patch”按钮可取消补丁试验，点击“Next stage”可将补丁过程推进至下一步，无论是否达到阈值。
         注意：当千兆欧姆封接形成时，弹出窗口会通知用户，同时会提示用户选择是否施加电击和强负压。
   5. 选择“是”以同时使用电击和抽吸进行穿孔；或选择“否”仅使用抽吸进行穿孔。
      注意当成功完成全细胞记录后，弹出窗口将提醒用户保存实验记录日志。
   6. 保存实验补丁日志。
      注意：如果封片尝试失败，将弹出一个窗口通知用户，封片程序将重置。
   7. 返回第 2.4 步，换一个细胞重复上述步骤。

结果

表1. 印刷电路板（PCB）与辅助数据采集（DAQ）板的连接配置。 使用本表将印刷电路板的输出端（左侧第一列）连接至数据采集板上的端口（左侧第二列）。辅助数据采集板上的端口名称与编号对应单端模式。

PCB 上的输出端口	DAQ 板上的端口名称	DAQ 板上的端口号	备注
DOUT V1	Port A channel 1	22	控制阀 1
DOUT V2	Port A ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCD相机	QImaging	Rolera Bolt
电生理系统	Scientifica	SliceScope Pro 2000	包含显微镜和操纵器。本文中演示的制造商提供的操纵器控制软件为 "Linlab2"。
放大器	Molecular Devices	MultiClamp 700B	计算机控制的微电极放大器
数模转换器	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED光源	Cool LED	pE-100	波长488nm
数据采集板	Measurement Computing	USB1208-FS	辅助DAQ。 使用手册见：http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
电磁阀	The Lee Co.	LHDA0531115H
气泵	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
气压传感器	Freescale semiconductor	MPXV7025G
切片固定装置	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	RC-40灌流室用切片锚定套件，平面型，2.0 mm，19.7 mm
Python	Anaconda	版本 2.7（Windows 32位）	https://www.continuum.io/downloads
螺丝端子（2针）	Sparkfun	PRT - 08084	螺距3.5mm的螺丝端子（2针）
N沟道MOSFET 60V 30A	Sparkfun	COM - 10213
DIP插座焊尾式 - 8针	Sparkfun	PRT-07937
基本红色LED 5mm	Sparkfun	COM-09590
基本绿色LED 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC桶形电源插座/连接器（SMD）	Sparkfun	PRT-12748
壁式交流适配器电源 - 12V直流 600mA	Sparkfun	TOL-09442
连接导线 - 混合型（实芯，22 AWG）	Sparkfun	PRT-11367
带锁母头转双公头三通阀	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 柔性管	Fisher scientific	14-171-129	外径：1/8 英寸 内径：1/16 英寸
BNC公头转BNC公头同轴电缆	Belkin Components	F3K101-06-E
560欧姆电阻（5%公差）	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II