离体大鼠结肠中结肠传入神经的电生理记录

摘要

来源：Meng, Y. 等，大鼠结肠传入纤维电生理特性体外表征。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种在离体大鼠结肠上记录结肠传入神经活动的方法。结肠两端被插管并灌注生理盐水以增加腔内压力。随着压力升高，神经信号增强，表明神经受到刺激。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 灌流液和测试化合物的制备

1. 配制5 L克雷布斯溶液：113 mM氯化钠（NaCl）、5.9 mM氯化钾（KCl）、1.2 mM磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、1.2 mM硫酸镁（MgSO₄）、25 mM碳酸氢钠（NaHCO₃）、1.2 mM氯化钙（CaCl₂）和11.5 mM葡萄糖。用95% O₂ + 5% CO₂混合气体饱和该溶液。将约500 mL充氧后的克雷布斯溶液预先在冰箱中冷却。
2. 根据需要配制储备测试化合物分装液（1 mM辣椒素溶于乙醇，10 mM 5-羟色胺（5-HT）溶于生理盐水）。在使用前，将储备液用克雷布斯溶液稀释至终浓度（用于浴槽给药），或用生理盐水稀释（用于管腔内给药）。

2. 记录电极的制备

1. 使用常规电极拉制仪从无内丝的标准玻璃管（外径 1.5 mm）中拉制记录电极。调整拉制仪的加热和拉伸参数，使拉制后电极的电极杆长度在 20 至 25 mm 之间。

3. 组织采集

1. 使用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行深度麻醉。
2. 在确保无菌条件下，使用手术刀沿腹壁正中线做切口，打开腹腔。将肠系膜及其他组织拨开，暴露结肠和直肠。
3. 将动物置于解剖显微镜下。通过精细解剖，找到左侧盆神经节（PG），并辨认与之相连的盆神经（PN）和腰内脏神经（LSN）。在距离PG几毫米处切断这些神经。
   注意： PG 位于直肠结肠交界处附近。通常有 3 - 4 条来自腰骶部脊髓的 PN 及一条 LSN 投射至 PG （图1）.
4. 切开耻骨联合以暴露直肠。清除周围组织（即， 膀胱 等等。在直肠上方操作时需小心，保留盆腔神经丛（PG）的完整性。
5. 通过静脉注射过量戊巴比妥处死大鼠。在距盆神经节（PG）上方约3 cm处横断结肠，使用镊子将结直肠组织从动物体内取出。
6. 将结直肠转移至盛有预冷克雷布斯液的培养皿中。用预冷克雷布斯液轻轻冲洗结肠，去除粪便。仔细去除残留的膀胱及其他组织，注意不要损伤盆神经节（PG）。

4. 结肠传入神经的解剖分离

1. 将结肠放入记录室（20 mL）中，并持续用含碳合气的克雷布斯（Krebs）溶液灌流组织，灌流速度设定为 15 mL/min。
2. 在口腔端和肛门端插管结扎直肠。以 10 mL/h 的流速从口腔向肛门方向开始对结肠进行腔内灌注生理盐水。
3. 在解剖显微镜下定位主要的盆神经节（PG）。使用昆虫针暴露神经节。通过精细解剖，找到从神经节发出并延伸至结肠的一条细小神经分支 (图 1)，并在靠近神经节处切断该神经。
   注意： 图 1 展示的是来自 PG 远端神经分支的记录。该神经可能包含骨盆神经与腰交感神经内脏传入纤维的混合成分。此外，也可在 PG 近端的盆神经（PN）和/或腰内脏神经（LSN）上进行记录。
4. 开启加热浴装置，加热克雷布斯溶液，使记录室温度维持在 34 ± 0.5 °C。

5. 吸附电极的制备

1. 取一支预先拉制好的玻璃移液管（步骤2），在解剖显微镜下进行检查。用一对镊子折断电极尖端，使其尺寸与待记录神经的直径相匹配。
2. 将尖端靠近打火机火焰进行斜面处理。

6. 电生理记录

1. 将斜面电极连接到电极夹持器上。将一个10 mL注射器连接到夹持器的侧端口，以向电极施加负压或正压。
2. 将夹持器连接到生物放大器的探头端，并将探头端安装到操纵器上。
3. 移动电极至组织浴槽，通过施加轻柔的负压，用Krebs溶液填充电极，直至溶液接触夹持器中的银丝。将电极尖端靠近神经的切断端，并施加负压，将神经吸入电极内。继续施加更强的负压，使约1 mm的神经被拉入电极并形成紧密封接。
4. 打开生物放大器，将滤波器设置为300 - 3,000 Hz。在示波器上监测信号，并使用配备峰电位数据处理软件的计算机记录神经信号（采样率为20 kHz）和管腔内压力信号（采样率为100 Hz）。

7. 测试结肠传入神经敏感性

1. 通过关闭引流套管上的三通阀，同时持续进行管腔内灌注，对结肠施加梯度扩张。监测管腔内压力，直至达到 60 mmHg，此时打开引流套管上的三通阀。

结果

图1. 大鼠结肠传入神经的电生理记录 体外. A. 一个示意图展示了 离体 “管状”结肠制备法的大鼠实验。将带有附着盆神经节（PG）的结直肠置于记录 chamber 中进行表面灌流，并在两端插管。通过注射泵实现腔内灌注，灌注方向为口侧至肛侧。通过关闭三通阀实现结肠扩张d在出口导管上。使用吸电极记录来自颈下神经节（PG）的一条细小神经分支。图中还显示了腰交感神经（LSN）的一个分支以及三条连接到颈下神经节（PG）的肺神经（PN）分支。 a投...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	上海西唐生物科技有限公司	B558
辣椒素	Sigma	M2028
电极拉制仪	MicroData Instrument Inc	PMP107
神经记录系统（生物放大器）	Digitimer, Ltd	Neurolog System
模数转换器	Cambridge Electronic Design	Micro1401
数据处理软件	Cambridge Electronic Design	Spike2 version 6
银丝	World Precision Instruments	EP12
玻璃管	World Precision Instruments	1B150-4
电极夹持器	World Precision Instruments	MEH3SBW
加热浴槽	Grant	GR150
解剖显微镜	Leica	Zoom2000
解剖显微镜	World Precision Instruments	PZMIII-BS
打火机	任意	NA
手术器械	World Precision Instruments	NA
昆虫针	自制，使用直径0.1 mm的不锈钢丝	NA
三维操纵器	World Precision Instruments	KITF-R
大鼠	任意	NA	可使用任意品系/性别。