评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能

摘要

来源：Rellick, S. L. 等. 脑血管内皮细胞中生物能量功能的评估. J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了使用细胞外通量分析法评估脑血管内皮（CVE）细胞的线粒体功能。将CVE细胞接种于细胞外通量细胞培养板中。在将细胞外通量传感器装入生物分析仪前，需对其进行水合、加载及校准。随后将含有细胞的培养板装入仪器进行分析。

方案

1. 在细胞培养板上接种并处理脑血管内皮（CVE）细胞

1. 将 CVE 细胞（bEnd.3 细胞）接种到 96 孔细胞外通量细胞培养板上：每孔 80 µL。将细胞培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。注意：每孔接种 16 × 10³ 个细胞，24 小时内可达到 60 - 80% 的融合度。
2. 若需对细胞进行化学处理，在细胞贴壁后（接种后 8 - 24 小时）加入处理试剂。
   注意：进行转染实验时，完全生长培养基中不得添加抗生素。

利用Bioanalyzer评估线粒体功能

1. 在开始检测之前，向微孔板中加入150 µL细胞外通量校准液，将细胞外通量传感器 cartridge 用校准液在37 °C、无CO₂条件下水合过夜。
2. 使用洗板机将细胞培养基更换为pH 7.0的细胞外通量检测培养基。将细胞在37 °C、无CO₂条件下孵育30–60分钟。
3. 在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制以下工作液：8 µM寡霉素、4.5 µM羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）、10 µM鱼藤酮和10 µM抗霉素A。将25 µL上述储备液分别加入cartridge的加样孔中：A孔加入寡霉素，B孔加入FCCP，C孔加入鱼藤酮和抗霉素A，并用细胞外通量检测培养基填充。按照表1所述实施检测程序。
4. 将已水合的cartridge装入生物分析仪中，点击“开始”按钮进行校准。校准完成后，取下cartridge底部平板，点击“卸载cartridge”提示，装入细胞板。继续检测直至所有测量完成。
5. 打开数据文件，从生物分析仪中获取速率值，并将数据导出至电子表格文件。

表1. 仪器运行程序。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
bEnd.3 细胞系	ATCC	CRL-2299	25–30 代
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ATCC	30-2002
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S12450	终浓度 10%
青霉素/链霉素	Hyclone	SV30010	1×100 储存液
0.25% 胰蛋白酶 0.03% EDTA 溶液	Corning	25-053-CI
丙酮酸钠	Corning	25-000-CI	终浓度 1.0 µM
葡萄糖	Sigma	CAS 50-99-7	终浓度 25 mM
寡霉素	Sigma	O4876	终浓度 1.0 µM
羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）	Sigma	C2920	终浓度 0.5 µM
鱼藤酮	Sigma	R8875	终浓度 1.0 µM
抗霉素 A	Sigma	CAS 1397-94-0	终浓度 1.0 µM
板洗站	Seahorse Bioscience
细胞外通量生物分析仪	Seahorse Bioscience	XFe96
细胞外通量细胞培养板	Seahorse Bioscience	102416-100
细胞外通量传感器微孔板	Seahorse Bioscience	102416-100
细胞外通量校准液	Seahorse Bioscience	100840-000
细胞外通量检测培养基	Seahorse Bioscience	102365-100	检测前调节 pH