评估脑血管内皮细胞的线粒体功能

摘要

来源:Rellick， SL et al. 脑血管内皮细胞生物能量功能的评估。J. Vis. Exp. （2016 年）

该视频演示了使用细胞外通量测定法评估脑血管内皮 （CVE） 细胞的线粒体功能。将 CVE 细胞接种在细胞外通量细胞培养板中。细胞外通量传感器在加载和校准到生物分析仪之前会水合。然后加载包含细胞的板进行分析。

方案

1. 在细胞培养板上接种和处理脑血管内皮 （CVE） 细胞

1. 在 96 孔细胞外通量细胞培养板上接种 CVE 细胞（bEnd.3 细胞）:80 μL/孔。将细胞培养板置于 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中。注意:每孔 16 × 10^{个 3} 个细胞将在 24 小时内达到 60 - 80% 的汇合度。
2. 如果细胞暴露于化学物质中，请在细胞附着到板底部后（接种后 8 - 24 小时）添加处理。
   注意:对于转染实验，请勿在完全生长培养基中添加抗生素。

2. 使用生物分析仪评估线粒体功能

1. 在检测开始之前，向板中加入 150 μL 细胞外通量校准液，并在 37 °C 下无 CO₂ 孵育过夜，用校准剂水合细胞外通量传感器小柱。
2. 使用洗板站，将细胞培养基更换为 pH 7.0 细胞外通量测定培养基。将细胞在 37 °C 无 CO₂ 下孵育 30 - 60 分钟。
3. 在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中制备 8 μM 寡霉素、4.5 μM 羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙 （FCCP）、10 μM 鱼藤酮和 10 μM 抗霉素 A 的工作溶液。将 25 μL 储备溶液加载到卡盒进样口中:端口 A，寡霉素;端口 B，FCCP;端口 C、鱼藤酮和抗霉素 A 与细胞外通量测定培养基。如表 1 所述实施测定方案。
4. 将水合小柱加载到生物分析仪中，然后单击"开始"按钮进行校准。校准完成后，点击"Unload Cartridge"提示符，取下小柱底板并加载细胞板。继续检测，直到所有测量完成。
5. 打开数据文件并从生物分析仪获取速率值。将数据导出到电子表格文件。

表 1.仪器运行方案。

材料