离体小鼠空肠节段肠系膜传入神经活动记录

摘要

来源：Nullens, S.，等。小鼠空肠和结肠节段肠系膜传入神经活动的体外记录。视觉化实验杂志（2016年）。

本视频展示了在离体小鼠空肠段上记录肠系膜传入神经电活动的过程，以研究组织压力和运动变化对传入神经活动的影响。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 空肠传入神经的制备

1. 对实验前已获得当地伦理委员会批准的青春期或成年啮齿类动物实施安乐死例如，终末镇静后进行心脏穿刺、颈椎脱臼， 等等。).
   注意： 采用颈椎脱位法处死动物，从而在后续组织处理过程中无需额外麻醉或术后护理 体外.
   注意： 年龄已被证明会减弱肠系膜传入机械感受功能，因此我们建议研究人员在单次实验过程中严格采用特定的年龄组。
2. 将处死的实验动物置于仰卧位，使用手术刀沿腹壁正中线切开皮肤和腹肌层，切口从剑突延伸至耻骨联合。
3. 用冰冷的Krebs溶液灌洗腹腔，以防止腹腔内组织干燥（Krebs溶液成分：120.03 mM NaCl，6.22 mM KCl，1.57 mM NaHCO₃）₂PO₄，15.43 mM NaHCO₃₃，1.21 mM MgSO₄₄，11.52 mM D-葡萄糖和1.52 mM CaCl₂₂).
4. 使用锐利的剪刀迅速切除整个空肠，从十二指肠空肠曲远端起始处开始，切除约20 cm的小肠段，注意避免损伤周围结构，并保持包含空肠血管和传入神经的肠系膜完整。
   注意： 对于腹腔内空肠的解剖，无需使用体视显微镜，因为肉眼即可清晰观察。
5. 将切除的空肠置于冰冻的克雷布斯溶液中，并在持续用碳酰气（95% O₂, 5% CO₂）氧合克雷布斯溶液的同时，将组织保持在冰上。₂，5% CO₂₂).
6. 用锋利的剪刀将空肠切成约3 cm长的肠段。观察位于各肠段近中心处的肠系膜束，其中包含血管和内脏神经。
7. 使用钝头导管以Krebs溶液冲洗每个肠段，以清除管腔内容物和食糜，因为这些物质含有消化酶，会加速组织样本的降解 体外.
   注意： 注意在冲洗过程中避免损伤环路的管腔，因为管腔破坏会导致 绒毛 将导致介质的释放，从而改变传入神经的活动。
8. 确定用于测量传入神经活性的节段（例如将Treitz韧带或十二指肠空肠曲远端的第一段空肠置于涂有硅胶弹性体层的专用记录室中。
   注意： 空肠的起始部在解剖学上定义为十二指肠悬韧带（Treitz韧带）跨越小肠的部位，也称十二指肠空肠曲。
   注意： 在实验开始前，提前用一层薄薄的硅胶弹性体覆盖记录室的底部。该弹性体层需按照制造商的说明进行制备。
9. 以每分钟10 ml的流速持续向灌流 chamber 中灌注温热的含碳合气克雷布斯液，并将记录 chamber 中克雷布斯液的温度保持在恒定的34 °C。
10. 将空肠段安装至器官浴槽中，使近口端连接提供管腔灌流的注射泵，远口端连接流出通道。轻微拉伸肠段，但注意避免施加过度张力。使用4/0丝线将两端牢固地结扎固定于进出液端口。
11. 将注射泵连接至口腔端，以10 ml/hr的流速向空肠节段腔内灌注Krebs溶液（未氧合，室温）。
12. 使用昆虫针将固定在支架上的肠段系膜平铺于硅胶弹性体底层。适度展开系膜以优化对系膜血管束的观察视野；注意不可对血管束或空肠施加牵拉张力。
13. 进行测试性梯度扩张（见下文 通过关闭输出端口，直至肠段管腔内压力达到60 mmHg，以确认安装的肠段无管腔内克雷布斯液泄漏。观察管腔内压力是否平稳上升，无中断现象。
14. 观察肠段在初始扩张阶段出现的小幅收缩（蠕动波）。如有需要，可通过向克雷布斯液中添加1 µM的L型钙通道阻滞剂硝苯地平，以抑制蠕动活性。
    注意： 在 Krebs 溶液中加入 1 µM 阿托品和硝苯地平可使肠段完全麻痹。
15. 在体视显微镜下，用两把小镊子轻轻牵拉肠系膜上的脂肪组织，逐步将其剥离，注意避免损伤埋藏在脂肪组织中的血管和传入神经。
16. 从空肠的远端开始，分离并暴露肠系膜束中的两条血管。
17. 观察两条血管之间作为被脂肪组织包裹的细小白线的近端空肠神经。当初始难以辨认两条肠系膜血管和/或传入神经时，仅需用镊子轻轻剥离脂肪组织，向空肠方向稍作近端解剖。
18. 剥离附着在神经上的脂肪组织，游离出数毫米长的空肠肠系膜神经段。
19. 使用锋利的组织剪刀横断神经。如有需要，用小镊子轻轻牵拉，剥离残留的脂肪组织、结缔组织以及神经外膜。
20. 使用显微操作器将连接有带活塞注射器的吸电极尖端放入器官浴槽中；然后通过调节活塞，轻柔地从器官浴槽中吸取少量克雷布斯溶液，使电极尖端浸入克雷布斯溶液中（图1）。确保克雷布斯溶液覆盖吸电极内部的金属丝电极。
    注意： 实验开始前，使用拉针仪制备含有导线电极的硼硅酸盐玻璃吸液毛细管。
21. 将吸电极的尖端紧靠横断的感觉神经纤维，将横断的神经纤维全长吸入毛细管内。
22. 将电极尖端移向脂肪组织，同时用力抽吸活塞，将脂肪组织吸入玻璃毛细管中，从而通过机械方式将神经与器官浴液内容物隔离开来，在毛细管内形成“密封”。
23. 使用数据采集系统验证传入神经活动的记录 例如，通过执行斜坡式扩张诱导传入神经放电增加（见下文将神经分离并吸入吸电极后，稳定制备状态15分钟，以在进行正式实验前获得稳定的自发传入神经活动。
24. 进行梯度扩张时，关闭输出端口以扩张肠段，使压力逐渐升高（最高至60 mmHg）。仅当连续三次梯度扩张（每次间隔15分钟）产生可重复的多单位放电时，才开始执行预定的实验方案。图2).

结果

图1：定制记录室与吸电极的示意图概览。 吸电极与记录室就位后的技术装置详细示意图。

图2：空肠传入神经活动体外记录的代表性轨迹图。 空肠多单位传入神经活动（imp.sec⁻¹）（上图）在基础状态及对两次升...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠 (NaCl)	VWR Chemicals	2,78,10,295	复合克雷布斯溶液
氯化钾 (KCl)	Acros organics	196770010	复合克雷布斯溶液
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)	VWR Chemicals	1,06,34,61,000	复合克雷布斯溶液
碳酸氢钠 (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	复合克雷布斯溶液
硫酸镁 (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	复合克雷布斯溶液
氯化钙 (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	复合克雷布斯溶液
D-葡萄糖	VWR Chemicals	1011175P	复合克雷布斯溶液
蒸馏水			复合克雷布斯溶液
PVC 管	Scientific Laboratory Supplies		肠段应固定在 PVC 管上
硅胶管	Scientific Laboratory Supplies		其余管路建议使用硅胶材质，便于清除管内碎屑
丝线	Pearsall Limited	10B15S220	将肠段固定于 PVC 管上
注射泵	Harvard Apparatus	55-2222	克雷布斯液的管腔内灌注
双目显微镜（目镜含 10 倍放大）	Zeiss STEMI 2000		传入神经解剖过程中的最佳可视化
恒温毯控制单元	Harvard Apparatus	507214	器官浴槽的加热
定制器官浴槽，底部覆盖 Sylgard 材料
Spike2 软件			数据的记录与分析
昆虫针，500 支，不锈钢，直径 0.2 mm	Austerlitz insect pins minutiens		传入神经的解剖
杜蒙特 #5 镊子，不锈钢，11 cm	World Precision Instrument	500341	传入神经的解剖
弹簧剪，14 cm	World Precision Instrument	15905	传入神经的解剖
DB digitimer	NL 108T2/10		压力传感器
显微操作器	Narishige	M-3333	吸电极的三维操控
显微操作器	X-4 旋转支架		吸电极的三维操控
显微操作器	GJ-8 磁性支架		吸电极的三维操控
光源	Euromex Microscopes Holland EK-1		传入神经解剖过程中的最佳可视化
CED 1401 记录装置			传入神经活动的记录
Humbug 50/60 Hz 噪声消除器	Quest Scientific Instruments		背景噪声的消除
输液泵	Gibson Minipuls 2		对固定肠段的器官浴槽进行灌注
微电极夹持半电池，1.5 mm	World Precision Instrument	MEH2SW	用于分离传入神经纤维的吸电极
硼硅酸盐玻璃毛细管，300 支；外径/内径 1.5/0.84	World Precision Instrument	1B150-4	用于分离传入神经的毛细管