建立用于犁鼻感觉神经元电生理记录的全细胞膜片钳技术

摘要

来源：Ackels, T.，等 小鼠副嗅球急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析。J. Vis. Exp. (2016)

该实验方案视频介绍了在小鼠犁鼻器（VNO）感觉神经元上建立全细胞膜片钳技术以进行电生理记录的方法。将带有荧光标记感觉神经元的冠状VNO脑片置于记录装置中，用记录电极对其中一个标记的神经元进行全细胞模式膜片钳，以记录其对化学刺激产生的电生理反应。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 溶液配制

1. 配制细胞外溶液 S₁：含有（单位：mM）145 NaCl、5 KCl、1 CaCl₂ 的 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲细胞外液₂，1 MgCl₂，10 HEPES；pH = 7.3（用NaOH调节）；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
2. 配制细胞外液 S₂：碳合气-氧合（95% O₂，5% CO₂）₂，5% CO₂₂) 含有（单位：mM）125 NaCl、25 NaHCO₃ 的细胞外溶液₃，5 KCl，1 CaCl₂，1 MgSO₄₄，5-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸（BES）；pH = 7.3；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
3. 制备 4% 低凝胶温度琼脂糖溶液（S₃用于组织包埋的试剂：4% 低凝胶温度琼脂糖。将 2 g 低凝胶温度琼脂糖溶解于 50 ml S₁ 在100 ml玻璃实验瓶中加入磁力搅拌子。将瓶子置于70 °C水浴中（瓶盖不要完全拧紧），搅拌约20分钟，直至琼脂糖完全溶解，溶液变为透明。随后冷却，并将熔化的琼脂糖置于42 °C的另一水浴中保温，备用。
4. 配制细胞内液 S₄：移液管液含（单位：mM）143 KCl、2 KOH、1 乙二醇四乙酸（EGTA）、0.3 CaCl₂、10 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 用甲磺酸调节至 7.3，游离 [Ca²⁺] 为 100 nM₂ （游离 Ca²⁺ = 110 nM), 10 HEPES, 2 腺苷-5′-三磷酸镁盐 (MgATP), 1 鸟苷-5′-三磷酸钠盐 (NaGTP)；pH = 7.1（用KOH调节）；渗透压 = 290 mOsm。
5. 调整 S 的组成₁，S₂ 和 S₄ 根据各自的实验设计（例如，药理学阻断剂用于分离特定类型的电压门控电流。

2. VNO 的分离与包埋

1. 通过短暂暴露于CO₂处死动物，并使用锋利的手术剪进行断头。注意：从处死动物到将犁鼻器（VNO）囊泡置于冰上之间的时间至关重要，应尽量缩短至2分钟以内。为保持组织活性，需在30分钟内将完全解剖出的双侧VNO包埋于琼脂糖中。
2. 使用大型手术剪移除下颌。从口腔腔内进入，分别剪断两侧的下颌骨及肌肉。
3. 将头部剩余部分倒置放入大培养皿中。
4. 用中号镊子轻轻牵拉上颌皮肤及鼻尖周围的组织，以更好地暴露门齿区域。
5. 使用骨剪以约45°角朝吻侧方向剪除门齿的大部分（图1A），以便于从鼻腔中取出VNO囊泡。
   注意：避免剪至牙根，以防损伤VNO囊泡尖端。
6. 用中号镊子夹住上腭的吻侧坚硬部分，以平缓角度小心地整体向后剥离（图1B）。
   注意：反复用冰冻S₂溶液冲洗。
7. 使用微型弹簧剪剪开犁骨尖端与下颌之间的骨性融合部分。将剪刀尖端插入，使其弯曲部分朝外远离VNO，沿VNO囊泡左右两侧的小步进方式小心剪断骨骼。
8. 为取出VNO囊泡，使用微型弹簧剪在尾侧切断犁骨，并用中号镊子小心将犁骨从鼻腔中提起。立即将VNO转移至置于冰袋上的立体显微镜下的小培养皿中，后续解剖步骤将在该处完成。
9. 用少量冰冻S₂溶液冲洗VNO，防止组织干燥。
10. 用中号镊子夹住犁骨后部，分离包含VNO软组织的软骨囊泡。调整囊泡位置以获得背侧视角，使两侧VNO之间的裂隙清晰可见（图1D_i）。
11. 使用精细镊子的尖端，在保持犁骨后部固定的同时，将两侧软骨性VNO囊泡从中央骨结构上分离。
    注意：仅在软骨囊泡边缘使用镊子，切勿刺穿软骨，因敏感的上皮组织极易受损。
12. 当两侧VNO完全分离后，开始去除包裹第一个VNO的软骨组织。
13. 用一把精细镊子夹住囊泡顶部边缘，剥离先前附着于犁骨（内侧）的软骨壁。
14. 为去除残留软骨，将VNO弯曲的外侧朝下放置于培养皿底部，并用镊子牢固固定一侧软骨。将第二把精细镊子从后方以极低的角度插入软骨与VNO之间，小心松解组织与软骨的连接。
15. 握住VNO的尾端，缓慢将其从软骨中剥离，避免损伤感觉上皮。
16. 一旦VNO从囊泡中分离出来，务必彻底清除所有残留的小块软骨，因任何残留软骨碎片均可能导致切片过程中组织与周围琼脂糖脱离。
17. 在第一个已解剖的VNO上滴加少量冰冻S₂溶液，以防止组织损伤。此时可见外侧一条较大的血管，提示器官结构完整，解剖过程中未受明显损伤（图2A_ii）。若血管受损，只要整体形态未明显破坏，仍可继续进行VNO切片。
18. 立即开始解剖第二个VNO。
19. 为包埋VNO，将两个小培养皿注满熔化的S₃溶液（储存在42 °C水浴中；见1.3节）至边缘。
20. 用精细镊子夹住VNO较宽的尾端，避免损伤感觉上皮。
21. 将VNO浸入琼脂糖中，并水平前后移动数次，以去除其表面的细胞外液薄膜及任何气泡。
22. 将VNO垂直放置，尾端朝下接触培养皿底部。调整方向时，避免直接夹持VNO，而是通过将镊子尖端靠近VNO进行微调。
    注意：包埋时的方向至关重要，因其决定了切片平面以及实验过程中对感觉神经元的可及性。
23. 将培养皿置于冰袋上，静置直至琼脂糖完全凝固。
    注意：一旦琼脂糖开始凝固，切勿再调整VNO方向，否则会导致组织与周围琼脂糖脱离。

3. 犁鼻器组织冠状切片

1. 用小刮勺将琼脂糖块从小培养皿转移至大培养皿的皿盖中，将琼脂糖块翻转，使犁鼻器（VNO）的尾端朝上。
2. 使用手术刀片将琼脂糖块切成锥形（顶端3–4 mm，底部8–10 mm），注意避免损伤包埋的组织。
3. 用超级胶水将锥形琼脂糖块固定在振动切片机样品板的中央，静置约1分钟，待胶水完全干燥。
4. 将样品板转移至切片室，并按相同步骤准备第二个VNO样品；将含第二个样品的样品板在4 °C条件下保存，直至使用。
5. 使用振动切片机，设置参数如下：切片厚度：150–200 µm；速度：3.5 a.u. = 0.15 mm/sec；频率：7.5 a.u. = 75 Hz。切片后，在解剖显微镜下快速检查切片形态，随后将切片转移至通氧孵育 chamber 中备用。切片可在数小时内使用。

4. 单细胞电生理记录

1. 进行记录时，使用配备水浸物镜、Dodt梯度对比或红外微分干涉对比（IR-DIC）以及落射荧光装置的直立固定式显微镜，并配备冷却电荷耦合器件（CCD）相机。数据采集使用膜片钳放大器、前置放大头阶段、模数/数模（AD/DA）转换接口板和计算机（含记录软件）。
2. 准备10–20根膜片钳移液管（4–7 MΩ）作为储备。使用微移液管拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径[OD] 1.50 mm，内径[ID] 0.86 mm）中拉制移液管，并用微熔炉进行火焰抛光。
   注意：在对体积较小的VSNs进行膜片钳操作时，对移液管尖端进行火焰抛光至关重要。这有助于在施加负压以形成高阻封接时防止细胞膜破裂。抛光后移液管开口直径应约为1 µm。
3. 将移液管存放于移液管储存罐中，以防损坏和积尘，直至使用。
4. 根据实验设计，通过向溶液储液罐和管路中填充液体来准备灌流系统。
   注意：必须彻底清除管路中的气泡，因为气泡会严重干扰电生理记录。
5. 调节压力以实现约3 ml/min的流速。
   注意：过高的压力会导致脑片移动并中断电生理记录。
6. 将VNO脑片转移至成像室，并使用带有0.1 mm厚合成纤维丝的不锈钢锚固定脑片位置（图2B–C）。
   注意：合成纤维丝不应覆盖脑片组织本身，而应覆盖脑片周围的琼脂糖。
7. 将成像室转移至记录装置，并通过浴式灌流持续以室温含氧S₂溶液对脑片进行灌流。
8. 调节吸出毛细管至液面位置，以产生缓慢吸力，实现浴液的持续交换。将8通道“灌流笔”（8-in-1 multi-barrel perfusion pencil）置于VNO脑片非感觉区域（含血管部分）上方并靠近该区域（图2C、3A）。将灌流笔与记录移液管从相对方向对准脑片，有助于实验操作。
9. 使用L形琼脂桥（内含150 mM KCl）连接参考电极与浴液。
10. 用移液管内液S₄填充膜片钳移液管。
11. 将移液管安装在连接至前置放大头阶段的镀氯化银膜片电极上，注意避免刮损镀层，并牢固固定。
12. 在移液管进入浴液前，施加轻微正压（约相当于10 ml塑料注射器上1 ml的推力）至膜片钳移液管。
13. 使用显微操作器将移液管降入浴液中，下降距离应足够远，以便物镜可浸入而不与移液管碰撞（图2D）。
14. 通过连接至前置放大头阶段的电生理软件监测移液管电阻（R_pip，应在4–7 MΩ之间）。
    注意：若R_pip <4 MΩ，则玻璃尖端已断裂；若R_pip >10 MΩ，则尖端很可能堵塞，需更换移液管。
15. 使用经红外优化的微分干涉对比（DIC）和CCD相机观察VNO脑片，并通过荧光照明及合适的滤光立方体识别表达FPR-rs3-i-Venus（FPR-rs3：甲酰肽受体相关序列3）的细胞（或其他类似标记的神经元）。
16. 根据实验设计，聚焦并定位荧光或非荧光细胞。
17. 接近细胞体时，使用手动旋钮以获得最大灵敏度。由于施加了正压，当移液管尖端接近细胞体时，可在细胞膜表面观察到微小凹陷。
18. 释放正压并施加轻微负压，以吸入细胞膜，形成高阻封接（1–20 GΩ）。施加短暂而轻柔的吸力以破裂细胞膜，建立全细胞记录构型。
19. 实验过程中持续监测接入电阻。
    注意：仅将表现出小且稳定的接入电阻（≤输入电阻R_input的3%；实验过程中变化 <20%）的神经元纳入分析。

结果

图1：犁鼻器的解剖。（A）小鼠头部侧面观，显示门齿切割的位置和角度。（B）腹面观，展示抓取并掀开上腭（UP）的最佳位置。（C）去除下颌、门齿和上腭后，显示容纳犁鼻器的软骨囊（CC）及犁骨（VB）的腹面观。（D）解剖后犁鼻器囊的背侧观，显示双侧犁鼻器的分布位置（D_i）。侧位观显示背侧软骨边缘，此处需将两侧犁鼻器分离（D_ii）。比例尺 = 1 mm（A–D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
琼脂糖（低凝胶温度）	PeqLab	35-2030
ATP（Mg-ATP）	Sigma-Aldrich	A9187
双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸（BES）	Sigma-Aldrich	B9879
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	E3889
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
GTP（Na-GTP）	Sigma-Aldrich	51120
(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Sigma-Aldrich	H3375
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	3564
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045
手术器械与耗材
大培养皿，90 mm	VWR		断头，VNO囊膜解剖
小培养皿，35 mm	VWR		VNO解剖用盖，琼脂糖包埋用培养皿
大型锋利手术剪	Fine Science Tools		断头，去除下颌
坚固骨剪	Fine Science Tools		切割门齿
中号镊子，Dumont #2 镊子	Fine Science Tools		去除皮肤和腭部
微型弹簧剪，8.5 cm，弯曲，7 mm 刀片	Fine Science Tools		切除VNO
两对精细镊子，Dumont #5 镊子	Fine Science Tools		从软骨囊中分离VNO
小型不锈钢刮勺	Fine Science Tools		处理琼脂糖块和组织切片
手术刀			将琼脂糖块切割成锥形
设备
放大器	HEKA Elektronik	EPC-10
硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.50 mm/内径0.86 mm）	Science Products
CCD相机	Leica Microsystems	DFC360FX
滤光片组，激发：BP 450-490，抑制：LP 515	Leica Microsystems	I3
荧光灯	Leica Microsystems	EL6000
磁力搅拌加热板	Snijders	34532
微电极拉制仪	Narishige	MF-830
显微操作装置	Luigs & Neumann	SM-5
垂直两步式微电极拉制仪	Narishige	PC-10
显微镜	Leica Microsystems	CSM DM 6000 SP5
50/60 Hz 噪声消除器（HumBug）	Quest Scientific
物镜	Leica Microsystems	HCX APO L20x/1.00 W
示波器	Tektronik	TDS 1001B
渗透压计	Gonotec	Osmomat 030
8通道灌流系统	AutoMate Scientific
pH计 five easy	Mettler Toledo
移液管储存罐	World Precision Instruments	e212
记录室	Luigs & Neumann	Slice mini chamber
刀片	Wilkinson Sword GmbH	Wilkinson Sword Classic
切片供氧储存室；替代的商用装置例如 BSK1 Brain Slice Keeper（Digitimer）或 Pre-chamber（BSC-PC；Warner Instruments）	定制
体视显微镜	Leica Microsystems	S4E
触发接口	HEKA Elektronik	TIB-14 S
振动切片机	Leica Microsystems	VT 1000 S
水浴锅	Memmert	WNB 45