使用多电极阵列监测致痫剂作用下的大脑皮层活动

摘要

来源：Lu, H. C.，等。小鼠脑片制备中癫痫样活动的直流电刺激与多电极阵列记录。J. Vis. Exp. (2016)。

在本视频中，利用多电极阵列（MEA）记录电生理信号，研究经颅直流电刺激（tDCS）对包含前扣带皮层（ACC）和丘脑区域的脑片的影响。通过施加电脉冲并灌注致痫药物，探讨ACC在癫痫发作中的响应特性。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备用于多电极阵列（MEA）记录的实验溶液与设备

1. 制备人工脑脊液（aCSF；124 mM NaCl、4.4 mM KCl、1 mM NaH₂PO₃、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、25 mM NaHCO₃ 和 10 mM 葡萄糖，用 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体饱和）。
2. 使用两种类型的多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA 和 8 × 8 MEA。前一种探针覆盖包含皮层、纹状体和丘脑的区域，后一种探针仅覆盖皮层区域。
3. 使用具有 0.1 Hz 至 3 kHz 带通滤波器（放大倍数为 1,200 倍）的 60 通道放大器，以 10 kHz 的采样率采集数据。
4. 在 MEA 腔室内放置两根镀银氯化银导线，用于直流电刺激（DCS）。然后使用这些镀银氯化银导线，通过隔离刺激器产生电场。
5. 放置一根钨电极（直径 127 µm，长度 7.62 cm，8° 交流锥形尖端，阻抗 5 MΩ）用于丘脑刺激，并将参考电极置于 MEA 腔室内。通过由脉冲发生器控制的隔离刺激器向钨电极输送电流（图 1）。

2. 脑切片制备

1. 使用4-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。将动物饲养在空调房间内（21-23 °C；50%湿度；12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为上午8:00），自由摄食和饮水。
2. 取步骤1.1中配制的aCSF 250 ml，置于装有冰块的烧杯中。同时，持续通入由95% O₂ 和5% CO₂ 组成的混合气体。
3. 手术
   1. 在玻璃麻醉盒中使用4%异氟烷对动物进行麻醉，时间约为3分钟。当动物达到手术深度麻醉状态（表现为脚趾夹捏无反应）时，将其置于装有碎冰的浅盘上，并用剪刀迅速断头。
   2. 暴露颅骨并清除残留肌肉组织。接着使用咬骨钳剥离脑部背侧的颅骨，再用咬骨钳修剪颅骨两侧。所有手术器械均需用75%乙醇溶液进行消毒。
   3. 使用解剖刀沿脑腹侧切断嗅球及其神经连接，并取出脑组织。断头后立即把脑组织转移至盛有冰冻含氧aCSF的烧杯中。
4. 丘脑内侧核（MT）-前扣带皮层（ACC）脑切片的制备
   注意：制备包含从MT到ACC通路的脑切片
   1. 使用刀片手动对脑组织块进行切割，在两侧半球距中线外侧2.0 mm处各做一次矢状切面，以暴露皮层下结构。然后进行两次斜向切割：第一次横切平行于纹状体内可见的纤维束。
   2. 第二次横切从小脑与视觉皮层之间的连接处，延伸至前连合与视束之间腹侧中点，该切面应与丘脑-扣带回通路平行。
   3. 使用氰基丙烯酸盐胶水将脑组织块固定在角度板（约120°）上，在通路转折点稍上方进行一次切割。随后展开角度板并将其展平，再粘附到振动切片机的切片室载物台上。
   4. 制备500 µm厚的丘脑内侧核-ACC脑切片，立即浸入冰冻含氧aCSF中。将切片转移至记录室，在持续灌流（12 ml/min）含氧aCSF的条件下，于32 °C孵育1小时。

3. 多电极阵列记录用灌流室的制备

1. 灌流室的准备
   1. 将MEA探针放置在多通道系统上，并使用两条独立的聚乙烯管将探针连接至蠕动泵。其中一条管用于将aCSF导入MEA室，另一条管用于将aCSF导出。最后，以温热（29–30 °C）且充氧的aCSF持续灌流样本（8 ml/min）。
2. 将脑片转移至MEA。使用湿润的棉签固定脑片，小心移动脑片，确保前扣带皮层（ACC）位于电极上方。
3. 使用脑片固定套件和压片装置压紧脑片，以确保脑片与电极之间形成良好的电接触。

4. 通过直流电刺激生成电场

注意： 电场方向的定义基于前扣带皮层（ACC）中轴突-树突轴的方向。树突和胞体区室的方向通过高尔基染色法确认12。

1. 将 AgCl 电极（定义为阳极）放置在靠近 ACC 的位置，并将另一电极（定义为阴极）放置在远离 ACC 的位置。通过 MEA 记录由两个场方向（平行于和垂直于 ACC 轴突-树突纤维）产生的电场强度，并使用刺激器施加电场电流。
2. 固定 AgCl 电极之间的距离（约 1.5–2 cm），并调节刺激器的电流强度，使直流电刺激（DCS）介于 0.5 至 2 mA 之间。

5. 电刺激诱导的皮层突触反应

注意：通过在 MT 区施加电刺激来诱导 ACC 区的突触反应，其中可编程电刺激发生器产生矩形双相电流脉冲。

1. 重复上述第3节操作。
2. 将一根钨电极放置于丘脑（MT），并通过双极钨电极向脑片的丘脑区域传递刺激器发出的脉冲。
3. 使用不同的电流强度以确定引发前扣带皮层（ACC）反应的阈值。此处使用 ±150 µA 的强度和 200 µsec 的持续时间，在大多数脑片中可引发ACC 80%的最大反应。
4. 在MT-ACC脑片的丘脑-扣带通路（从MT至胼胝体）上移动钨电极，以获得最佳的反应曲线。
5. 记录10-20次ACC反应的扫描数据，并使用软件自动对所有由MT刺激引发的ACC反应进行平均。结果即为通过MT-ACC通路的MT刺激所诱导的ACC突触反应。

6. 电刺激诱导的类癫痫发作活动

注意： 通过给予4-氨基吡啶（4-AP；250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline；5 µM）诱导类似癫痫发作的活动。既往的时间对照研究表明，药物给予后2-3小时出现最大且稳定的反应14。

1. 重复上述第5节操作。
2. 向灌流液中加入药物：使用4-AP（4-氨基吡啶）（250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline）（5 µM）。将药物充分混匀后，继续灌流2–3小时。
3. 为促进类似癫痫样活动，保持灌流泵在相对较快的流速（8 ml/min），这也有助于防止pH梯度的形成。
4. 将钨电极置于MT区域，并施加电刺激（150 µA，持续时间200 µsec），以获取ACC反应谱型。
5. 进行10–20次扫描，并对反应信号进行平均处理。
6. 用新鲜的aCSF更换灌流液，以洗脱药物。重复步骤6.5。

结果

图1：丘脑-扣带回切片制备及MEA记录系统设置。（A）丘脑-前扣带回（MT-ACC）脑片制备流程：（a）取出脑组织；（b）转移至冰冷的含氧人工脑脊液（aCSF）中；（c）从正中线开始进行两次旁矢状面切割；（d）脑组织块内侧部分的侧面视图；（e）对脑组织块进行两次倾斜的腹侧切割；（f）将脑组织块粘附于倾斜的塑料板上；（g）进行一次背侧切割并展开脑组织块；（h）将脑组织块固定于振动切片机上；（i）从脑组织块中收集脑切片。（B）MEA记录系统装置示意图。（C）MEA记录区域：（a）MEA探针；（b）MEA电路；（c）脑切片的前扣带回（ACC）区域位于电极探针上方。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
aCSF（总量：1 L）：
D-(+)-葡萄糖	MERCK	1.08337.1000	10 mM
碳酸氢钠	MERCK	1.06329.0500	25 mM
氯化钠	MERCK	1.06404.1000	124 mM
(+)-L-抗坏血酸钠，>=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
无水硫酸镁，ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
二水氯化钙	MERCK	1.02382.1000	2 mM
一水磷酸二氢钠	MERCK	1.06346.1000	1 mM
氯化钾	May & Baker LTD Dagenham England	MS 7616	4.4 mM
(+)-荷包牡丹碱	TOCRIS	130	5 µM in aCSF
4-氨基吡啶	TOCRIS	940	250 µM in aCSF
振动切片机	Vibratome	Series 1000	将组织块切成 500 µm 厚的切片
多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA	Multi Channel Systems	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	电极直径 30 µm；电极间距 500 µm；阻抗 50 kΩ（200 Hz 时）
多电极阵列（MEA）探针：8 × 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	锥体形电极；直径 40 µm；尖端高度 50 µm；电极间距 200 µm；阻抗 1,000 kΩ（200 Hz 时）
使用 60 通道放大器，带通滤波器设置为 0.1 Hz 至 3 kHz，放大倍数为 1,200 倍	Multi-Channel Systems	MEA-1060-BC
MC Rack 软件，采样率为 10 kHz	Multi-Channel Systems		用于数据采集和记录的软件
脉冲发生器控制	Multi-Channel Systems	STG 1002
切片固定套件和压片装置	Warner Instruments	SHD-26H/10; WI64-0250
蠕动泵 - minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	灌流速率：8 ml/min
隔离式刺激器	A-M Systems	Model 2100	刺激强度 ±350 μA，持续时间 200 μsec
钨电极	A-M Systems	575300	置于丘脑内