在清醒小鼠中研究抑制性神经递质阻断剂存在下的听觉神经元反应

摘要

来源：Ayala, Y. A.，等。清醒小鼠中神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微离子电泳应用相结合。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了对小鼠大脑中处理听觉刺激的特定区域的神经元活动的研究。该技术包括施加一种抑制性神经传递阻断剂，并在药物作用于局部脑区前后，比较神经元对听觉刺激的反应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微离子电渗入药物

注意：用于微电泳的药物在水溶液中必须带有电荷。请查阅文献以确认目标药物是否适用于本实验方法。此处以GABA_A受体拮抗剂加巴嗪（gabazine）为例描述该操作流程。

1. 使用 0.2 μm 注射器滤膜过滤蒸馏水，以灭菌并确保其中不含任何溶质。用此蒸馏水配制约 1,000 μl 的 20 mM 加巴青溶液。
2. 使用细尖 pH 电极，并用经 0.2 μm 滤膜过滤的 NaOH 将稀释液的 pH 调整至 4。
3. 将 100 - 200 μl 分装后于 -20 ºC 保存。在记录当天解冻。当天，在固定动物之前，使用装有柔性塑料针头的 100 μl 微量注射器，向多管电极的管腔（每管 3 - 5 μl）中填充药物。

2. 手术与头固定装置植入

1. 使用两只雄性CBA/J小鼠（Mus musculus），体重分别为27 g和30 g，进行实验。
2. 手术前数天，对动物进行抓握操作，并让其在记录室中自由探索，以使其适应环境。每天进行三次训练，每次持续至少30分钟。这将使小鼠在记录过程中保持镇静并感到舒适。
3. 通过肌肉注射给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以麻醉小鼠。该剂量可使动物深度麻醉约1小时。根据需要，追加初始剂量三分之一的补充剂量。
4. 将动物置于设定温度为38 ± 1 ºC的加热毯上，并使用两个耳杆和一个门齿杆将动物头部固定在立体定位仪中。注意避免耳杆刺破鼓膜。
5. 通过滴加一滴眼用凝胶保护眼睛。
6. 使用剪刀剃除头皮毛发，并用聚维酮碘对皮肤进行消毒。
7. 使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并剥离覆盖顶骨及枕骨前部的骨膜。
8. 将一个轻质硬铝材质的头固定柱（重量约0.65 g，长度30 mm，图1A）粘接在颅骨上，其底面为圆形且平整（直径5 mm）。将一根银丝粘接在头固定柱中部，两端保持自由。该银丝将作为电生理记录的参考电极。
9. 在颅骨和头固定柱底面涂一层薄薄的光固化粘合剂。等待10秒后，将头固定柱置于顶骨前部区域的中线上。
10. 使用蓝光光源照射20秒，使粘合剂充分固化，以确保牢固粘接。
11. 使用电钻和小型钻头，在头固定柱底座周围及后方钻三个小孔。
12. 将两个手表螺丝（长约2 mm）旋入钻好的孔中，作为颅骨与头固定装置之间的额外接触点。螺丝需旋转1½圈以达到紧密贴合。使用镊子测试螺丝，确保其无松动。
13. 将接地银丝的尖端插入第三个孔中，确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水氰基丙烯酸酯胶水，将导线固定在颅骨上。
14. 使用光固化复合树脂加固头固定柱与颅骨之间的连接。覆盖头固定柱底座、银丝下部以及螺丝部分，注意不要延伸至λ点后方，以便记录时操作。使用蓝光光源进行固化。
15. 牵开颈部后方肌肉在其颅骨附着处附近的组织。使用小型环钻（直径2.35 mm）在λ缝下方略偏外侧的位置钻一个圆形窗口，以暴露下丘（IC）。当骨缘松动后，用精细镊子轻轻提起覆盖的骨片。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗止血。
16. 使用复合树脂在窗口周围构建一个小型围堰（宽约1 mm，高约1 mm），并进行光固化。
17. 在暴露的颅骨和肌肉表面涂抹抗生素软膏。然后用无菌生理盐水润湿下丘暴露面，并覆盖一层凡士林，填满围绕记录窗口所形成的凹槽。
18. 皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg，用无菌生理盐水稀释1:10）作为镇痛剂。
19. 将动物留在加热毯上直至苏醒，然后将其放回饲养笼中恢复三天后再开始记录。将动物单独饲养在大鼠饲养笼中，以防止同笼动物舔除凡士林或触碰金属网格盖。当动物单独饲养时，应在笼内提供一定的环境丰富化设施。同时每日更换木屑以预防感染，并仔细检查动物恢复情况，确保无不适表现。此外，还需检查凡士林是否覆盖记录窗口，以保护暴露的脑组织。

3. 电生理记录与微电泳

1. 恢复后，让动物有足够时间适应记录环境并保持头部固定。将小鼠置于根据其体型定制的带衬垫泡沫固定装置中，并将头柱固定在支架上（图1B），以限制其活动并有助于保持安静状态。
2. 初始训练阶段采用10分钟的训练时段，逐步延长至最长120分钟。在训练期间，以甜味液体（如炼乳，按30:70比例稀释于水中）在固定时间间隔给予动物奖励。后续在记录期间，可在时段开始、结束时或未记录到单个神经元活动时给予相同奖励。
3. 若动物在记录前表现出兴奋状态，可注射轻度镇静剂乙酰丙嗪（2 mg/kg，腹腔注射）。需注意，镇静剂可能影响目标神经系统的记录结果。
4. 让动物在记录舱内自由探索5–10分钟。
5. 将动物身体放入定制的带衬垫泡沫固定装置中（图1B）。
6. 将头柱固定于连接在立体定位架上的支架中（图1C）。此时可给予动物一次液体奖励。
7. 用棉质毯子覆盖动物身体，并使用半圆形塑料罩和胶带松散固定。
8. 清除记录窗口处的石蜡油，并用温热的无菌生理盐水冲洗。
9. 记录神经活动并进行离子电泳给予加巴喷丁（gabazine）。
   1. 将多管电极安装至由微驱动器控制并连接于显微操作器的电极架上。
   2. 使用小型鳄鱼夹连接记录导线：正极端连接至钨电极末端，接地端连接至与硬脑膜接触的银丝。
   3. 在每根电极管内插入未涂层的银丝，使其一端接触溶液，另一端可外接。根据制造商说明，将这些端口连接至离子电泳装置。
   4. 移动多管电极，使其尖端接触脑表面。使用温热的无菌生理盐水润湿以防止脑组织干燥。此时施加保持电流（gabazine为-10 nA；具体药物请参考相关文献），以防止药物从电极管尖端泄漏，同时寻找单个神经元活动。
   5. 采用标准技术分离单个神经元的细胞外放电活动，获取该神经元的频率响应区（FRA），即能够引发神经元反应的声音频率与强度组合，反映其对特定声音的敏感性。
   6. 选择两个能引发相似放电频率和模式的频率（f1 和 f2），在“偏差刺激范式”（oddball paradigm）中分别作为稀有刺激和重复刺激呈现。
      注意：简而言之，在偏差刺激范式中，一个频率（f1）作为高概率重复刺激呈现，而另一个频率（f2）作为低概率偏差刺激随机穿插其中；在第二组偏差刺激序列中，两种刺激的相对概率互换。
   7. 通过将电流切换为正向值（10–20 nA）释放加巴喷丁。再次获取FRA，并在药物作用下重复偏差刺激范式。持续施加药物直至观察到明显的放电频率变化；通常需要5–20分钟，具体时间取决于药物种类、浓度及推出电流强度。重复记录流程以获取药物作用下的数据。
   8. 将电流恢复至保持值以停止给药。通过监测FRA或对偏差刺激范式的反应是否恢复至对照水平，判断药物效应是否已完全洗脱。
      注意：每日记录会话可持续2–3小时，若动物出现不适或挣扎迹象，应提前终止。记录结束后给予液体奖励，并用石蜡油覆盖记录窗口。

结果

图 1. 清醒小鼠记录用附件。（A）头固定柱。（B）定制的带软垫泡沫固定装置。将小鼠置于两块泡沫之间，头部露于外侧。（C）立体定位仪框架的改装。头固定柱夹持器（上横杆）在植入头固定柱时提供辅助，并在记录期间固定头部。咬合板（下横杆）仅在植入头固定柱时使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨丝	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 英寸 × 3 英寸
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus LTD	30-0053	无灯丝标准壁硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长 100 mm
多通道玻璃毛细管	World Precision Instruments	5B120F-4	5 通道毛细管，长 4 英寸，外径 1.2 mm，带灯丝
Diaplus	DiaDent	2001-2101	光固化粘合剂，用于将钨电极固定在玻璃多通道移液管上
G-Bond	GC Corporation	2277	光固化粘合剂，用于将头固定装置粘附至动物颅骨
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	光固化复合材料，用于增强头固定装置与颅骨之间的粘合强度
Araldit Cristal	Ceys		双组分环氧树脂，用于进一步加固钨电极与玻璃多通道移液管的连接
加热毯	Cibertec	RTC1
立体定位仪	Narishige	SR-6N	适用于小鼠的改装型号
微离子电渗装置	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	包含 IP-2 离子电渗泵（每个药物输送通道各一个）及平衡模块
多通道玻璃移液管拉制仪	Narishige	Model PE-21
LED 灯	Technoflux	CV-215	5 W，430–485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	柔性塑料针头，34 号规格（AWG）
Imalgene	Merial		氯胺酮，100 mg/mL
Rompun	Bayer		赛拉嗪，20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	用蒸馏水配制约 1000 µL 的 20 mM Gabazine 溶液，并将 pH 调至 4