记录神经元-星形胶质细胞共培养体系中神经网络的电生理活动

摘要

来源：Taga, A.，等。利用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞和神经元建立肌萎缩侧索硬化症电生理研究平台。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了建立神经元-星形胶质细胞共培养体系以记录神经元网络活动的方法。将运动神经元与星形胶质细胞共培养于多电极阵列（MEA）培养板上后，利用MEA对外记录神经元网络的同步节律性电活动。

方案

1. 在多电极阵列板中共同培养运动神经元与脊髓星形胶质细胞

1. 将运动神经元和星形胶质细胞在准备好使用的当天进行分化并接种，使其年龄达到第 d 天 体外 （DIV）60用于运动神经元，DIV 90用于星形胶质细胞。
2. 在接种前一日或接种当天，按照如下步骤对24孔塑料培养板进行MEA包被处理（材料表).
3. 将多聚鸟氨酸（PLO）溶于水或磷酸盐缓冲液（PBS）中，稀释至100 µg/mL。
   1. 向每个孔中加入15–20 µL（根据移液操作的熟练程度调整），使液滴位于孔中央，覆盖电极区域及周围区域，但不覆盖整个孔。
   2. 注意避免移液器吸头损坏电极。各孔之间的加样体积应保持一致，以确保每孔中的电极表面覆盖面积相同。
   3. 将PLO在37 °C孵育至少1小时（建议2小时）。
      注意： 小体积液体在培养板中若湿度过不足会干燥。向孔周围的区域加水，以确保包被和记录过程中始终维持足够的湿度。
4. 尽可能使用塑料移液吸头吸出多聚赖氨酸（PLO）溶液，注意不要触碰电极。用 250 µL 水洗涤三次。若使用真空抽吸器进行洗涤，切勿使吸头靠近电极阵列。第三次洗涤后，必要时使用移液吸头尽可能吸干残留水分。取下盖子，在细胞培养罩内让表面自然晾干。
5. 待培养板表面干燥后，加入用PBS稀释至10 µg/mL的层粘连蛋白，每块电极阵列使用15–20 µL覆盖表面。向湿度槽中加入水，盖上盖子，将培养板放回37 °C培养箱中孵育至少2小时，最长可过夜。
6. 铺板当天，用 PBS 清洗运动神经元（MN）和星形胶质细胞培养物一次，加入 0.05% 胰蛋白酶，在 37 °C 条件下消化细胞（5 分钟）。将细胞收集至含有胰蛋白酶抑制剂的 15 mL 圆底离心管中，并用培养基或基础液冲洗培养板，确保所有细胞均被收集。在 300 x g 孵育5分钟，然后用1000 µL移液器重悬，制备成1 mL单细胞悬液。重悬微神经元（MN）和星形胶质细胞时，更换为共培养培养基（表1），并添加20 µM Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（ROCK-I）。
7. 使用血细胞计数板平行计数微核（MN）和星形胶质细胞。计数和计算过程中，盖紧细胞悬液管帽，并将其置于4 °C的泡沫塑料架中。
8. 计算将菌液重悬至浓度为 5 x 10⁶ CFU/mL 所需的体积⁴ 每5 µL中的细胞数，运动神经元为2.5 × 10⁴ 每5 µL含星形胶质细胞。将1 mL细胞悬液在300 x g 5 分钟后重悬于计算好的体积中。
9. 计算所需接种的孔数，乘以每孔5 µL细胞悬液。按1:1比例混合神经元和星形胶质细胞悬液，用移液器吹打混匀（通常两次），确保充分混合，但避免过于剧烈。
10. 使用移液枪头从MEA板的每个孔中移除层粘连蛋白。将10 µL最终混合的细胞悬液转移至每个孔中，形成覆盖电极阵列的小液滴，使细胞密度达到5 x 10⁴ MN 和 2.5 x 10⁴ 每孔星形胶质细胞。
    注意： 接种过程中，由于混合悬液中细胞密度较高，需在各孔之间频繁重悬，以确保细胞计数准确且一致。
11. 将培养板放回培养箱中孵育20–30分钟。注意不要扰动细胞液滴，使细胞在培养板上形成初始贴附。
12. 孵育20–30分钟后，用移液器将250 µL预热的共培养培养基加有ROCK抑制剂（ROCK-I）沿每孔孔壁缓慢加入，再于同一孔的对侧孔壁缓慢加入额外的250 µL。将培养板放回培养箱中继续培养。
13. 接种后次日（共培养第1天）观察培养皿。若存在大量细胞碎片或死细胞，则更换为含ROCK-I的新鲜共培养培养基；否则，在接种后第二天（共培养第2天）更换为不含ROCK-I的共培养培养基。每周进行两次半量换液（吸除50%培养基，并加入最终体积60%的新鲜培养基以补偿蒸发损失）。
14. 若使用带有单孔30 mm玻璃板的MEA系统（材料表），制备平板可能需要2天或更长时间。请按照以下步骤进行操作。
15. 用0.05%胰蛋白酶将前次MEA培养物中的细胞和细胞碎片消化5-15分钟。
16. 吸除胰蛋白酶，并用清水洗涤三次。
17. 用70%乙醇灭菌，在超净台中孵育10分钟。吸除乙醇，再用清水冲洗三次。
18. 使用含蛋白酶的1%阴离子洗涤剂水溶液。将培养板盖上盖子，用热塑性薄膜和铝箔包裹，然后在室温下置于摇床上过夜。
19. 吸出洗涤剂，然后用清水冲洗三次。
20. 若计划储存培养板，请加入足量水。用盖子盖好培养板，再用热塑性薄膜和铝箔包裹，置于冰箱中冷藏，待下次使用。
21. 若计划进行包被，请在细胞培养罩内让表面自然干燥。
22. 如果需要额外灭菌（例如既往存在感染或非近期使用），此时仅在此阶段将MEA平板置于超净台内紫外（UV）灯下照射30–60分钟。
    注意： 避免频繁使用紫外线照射可防止电极受损。当培养板上有血清时使用紫外线照射会导致电极功能失活，因此紫外线仅可用于已清洁的培养板。
23. 当培养板完全干燥后，进行1分钟的等离子清洗，以对MEA板的玻璃表面充电并增强包被效果。每进行4-5次MEA板清洗-培养循环后，至少进行一次等离子清洗。
    1. 作为替代方案，当无法或无需进行等离子清洗时，加入足量含胎牛血清（FBS）的培养基以覆盖MEA板表面，并将其放回培养箱中过夜。
24. 使用PLO（多聚鸟氨酸）/层粘连蛋白包被。在等离子清洗后，或吸除含FBS的培养基并冲洗后，立即加入PLO溶液（100 µg溶于PBS中）。
25. 按上述方法以以下密度接种细胞：1 x 10⁵ 人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）/ 培养板及 5 x 10⁵ 人诱导多能干细胞来源的运动神经元（hiPSC-MN）/培养板

2. 多电极阵列记录

1. 使用 Butterworth 滤波器（200 Hz 高通和 3 kHz 低通滤波）以 12.5 kHz 的采样频率提取原始电压数据。将尖峰识别设定为电压瞬时时间点超过基线 6 个标准差的事件。将簇状放电定义为在 100 ms 内出现 >5 次尖峰的活动。当在 100 ms 内超过总活跃电极数 35% 的电极放电，且每次网络簇状放电至少产生 50 次尖峰时，定义为网络活动。
2. 从共培养（CC）第 1 天起尽快开始记录。
   注意：在共培养第 3 天之前通常很少观察到电活动。
3. 在进行生化检测、免疫细胞化学（ICC）或定量 PCR（qPCR）时，将平行培养物以相似密度接种于相应的培养板或盖玻片上，并设置重复样本。
4. 设置记录温度为 37 °C，CO₂ 浓度为 5%。将培养板转移至仪器中，并在记录前至少平衡 5 分钟。
5. 根据实验设计，每隔一天或每周记录一次基线活动，每次持续 1–15 分钟。在更换培养基后至少 1 小时内不得进行记录，理想情况下每次换液后应等待 24 小时。
6. 为防止污染，若无菌培养板的盖子需在无菌操作台外打开（例如施加药物化合物），则在任何记录后更换培养基（即进行步骤 1.14 中的半量换液）。如果培养板将在药物处理后继续使用，则需进行完全换液和洗涤以清除药物。
7. 为分析目的，每种条件至少使用三个技术重复和生物学重复。电生理数据以 n ≥ 3 个重复的均值表示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 无菌培养皿	Falcon	353003
25 cm2 无菌培养瓶	Falcon	353136
500 mL 0.2 µm CA 滤器系统	Corning	430769
5 mL 移液管	Falcon	357543
6 孔无菌培养板	Falcon	3046
Axion CytoView MEA 24 孔板（M384-tMEA-24W）	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA 平台	Axion	Maestro Edge
基底膜基质 - Matrigel	Corning	354277	实验方案中的细节
台式显微镜（在细胞培养罩内保持无菌）	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
睫状神经营养因子（CNTF）	Peprotech	450-13	将100 µg溶解于1 mL无菌PBS中，然后加入9 mL无菌0.1% BSA-PBS，配制成10 µg/mL溶液。分装后于-80 ºC冷冻保存。使用时按1:1000稀释（工作浓度为10 ng/mL）。
CO2 Axion Edge 的储液罐和调节器	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	赛默飞世尔科技	113300	工作浓度 1x
Essential 8 培养基 + Essential 8 添加剂	Thermofisher	A1517001	将10 mL Essential 8（10倍浓缩液）混合  加入500 mL Essential 8生长培养基（1×）
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	16140071	工作浓度 1x
血细胞计数板	电子显微镜科学	63510-20
湿度可控细胞培养箱	赛默飞世尔科技	370	设定为 37 ºC，5 % CO2
层粘连蛋白	赛默飞世尔科技	23017-015	储存液浓度 1 mg/mL，工作浓度 10 µg/mL（包被），1 µg/mL（细胞培养基）
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030	将2 mg LDN溶解于500 µL氯仿中，配制成10 mM储备液。分装后于-80 ºC保存。使用时，先将储备液用DMSO按1:10稀释至1 mM，再将1 mM溶液按1:5000比例加入所需培养基中，得到0.2 µM的工作溶液
MEA 玻璃板	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr	工作浓度 100x
多通道移液器 P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	赛默飞世尔科技	21103049
非必需氨基酸（NEAA）	赛默飞世尔科技	11140050	工作浓度 1x
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	工作浓度 100x
多聚鸟氨酸（PLO）	Sigma-Aldrich	P3655	工作浓度 100x
氯化钾（KCl）	NA	NA	将100 mg溶解于1 mL去离子水中，配制成100 mg/mL的母液。将母液分装至100 µL离心管中。（工作浓度为100 µg/mL）
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	工作浓度100 mM
ROCK抑制剂	Peprotech	1293823	离心后短暂离心再进行重悬。将100 µg溶解于1 mL PBS中，配制成100 µg/mL，然后加入9 mL无菌0.1% BSA-PBS，稀释至10 µg/mL。分装后于-80 ºC冷冻保存。使用时按1:1000稀释（工作浓度为10 ng/mL）。
无菌细胞培养罩	贝克公司	SG-600	将5 mg溶解于1480 µL的dH2O中，配制成10 mM的储存液，分装后于-80 ºC保存。使用时按1:500稀释（工作浓度为20 µM）。
补充剂 B - B27 补充剂	Thermofisher	21985023
台式细胞培养离心机	ThermoFisher	75004261	工作浓度 50x
热塑性薄膜 - Parafilm	PARAFILM	P7793	Sorvall Legend X1R
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	2530054	工作浓度 1x
水浴锅	赛默飞世尔科技	2332	Isotemp