小鼠脑血管内皮细胞中细胞内钙离子与膜电位的同步测量

摘要

来源：Hakim, M. A. 等. 在新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮中同时检测细胞内钙离子浓度与膜电位。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了小鼠脑动脉段内皮细胞中细胞内钙水平和膜电位变化的同步测量。分离的内皮管被加载荧光钙指示剂，并用一种诱导细胞内钙释放的药物处理，从而引起膜电位的变化。通过该指示剂的荧光可测量钙水平，同时将记录电极插入细胞以测量膜电位的变化。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 大脑动脉的解剖与分离

注意：所有解剖操作均需通过体视显微镜进行样本放大（最高达50倍），并使用光纤光源提供照明。为完成脑组织和动脉的分离解剖操作，应使用经过 sharpened 的解剖器械。用于分离和清理动脉的显微解剖工具包括尖端 sharpened 的精细镊子以及Vannas型解剖剪（刀片长度3至9.5 mm）。

1. 小鼠脑组织的分离
   1. 麻醉一只 C57BL/6 小鼠（3–30 月龄；雄性或雌性） 通过 吸入异氟烷（3%，2–3 分钟），在完全麻醉诱导后立即斩首处死动物。将头部置于含有冷（4 °C）无钙（zero Ca）的培养皿（直径 10 cm，深度 1.5 cm）中²⁺ 在体视显微镜下使用生理盐溶液（PSS）。
   2. 在显微镜下观察，去除颅骨表面的皮肤和毛发，并用冰冷的无钙溶液清除多余血液²⁺ PSS。使用标准解剖剪刀的尖端（例如，24 mm 刀片），从枕骨开始，沿颅骨的鼻骨向上延伸，进行切开。
   3. 使用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，并分离结缔组织，以获取带有完整威尔氏环的脑组织。
      注意：<....

结果

图1：从脑组织中分离脑动脉 (A) 用解剖液分离出带有完整动脉的大脑（白色箭头指示大脑后动脉）。B) 大脑后动脉的放大视图（白色箭头；约3倍于 vs. 图A）。C用不锈钢针将分离的后脑动脉固定在标本皿中。D去除结缔组织后的脑后动脉。插图显示动脉的切割段；比例尺 = 500 µm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
胶原酶（H型混合物）	Sigma	C8051
二硫苏糖醇	Sigma	D8255
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
弹性蛋白酶	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
碘化丙啶	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM 染料	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
循环冷却器（Isotemp 500LCU）	ThermoFisher Scientific	13874647
聚甲基丙烯酸甲酯灌流室	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
玻璃盖玻片底（2.4 × 5.0 cm）	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
阳极氧化铝平台（直径：7.8 cm）	Warner Instruments	PM6 或 PH6
紧凑型铝制载物台	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
显微操作器	Siskiyou	MX10
体视显微镜	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
光纤光源	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
尼康倒置显微镜	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
相差物镜	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
荧光物镜	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) 和 40X (Plan Fluor)
尼康倒置显微镜	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
微量注射泵控制器（Micro4）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
防振台	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
放大器	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
前置放大器	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
函数发生器	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
数据采集系统	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
可听基线监测器	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
数字存储示波器	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
荧光系统接口、ARC 灯 + 电源、Hyperswitch、PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
温度控制器	Warner Instruments	TC-344B 或 C
管路加热器	Warner Instruments	SH-27B
阀门控制器	Warner Instruments	VC-6
管路流量控制阀	Warner Instruments	FR-50
电子拉制仪	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 或 P-1000
微电极抛光仪	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
硼硅酸盐玻璃管（匀浆用）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
硼硅酸盐玻璃管（固定用）	Warner Instruments	G150T-6
硼硅酸盐玻璃管（尖电极用）	Warner Instruments	GC100F-10
注射器滤器（0.22 µm）	ThermoFisher Scientific	722-2520
玻璃培养皿 + 活性炭 Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
范纳斯剪刀（3 mm & 9.5 mm）	World Precision Instruments	555640S, 14364
剪刀（3 mm & 7 mm 刀片）	Fine Science Tools (或 FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
锋利尖头镊子	FST	Dumont #5 & Dumont #55