小鼠脑血管内皮细胞中细胞内钙离子与膜电位的同步测量

摘要

来源：Hakim, M. A. 等. 在新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮中同时检测细胞内钙离子浓度与膜电位。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了小鼠脑动脉段内皮细胞中细胞内钙水平和膜电位变化的同步测量。分离的内皮管被加载荧光钙指示剂，并用一种诱导细胞内钙释放的药物处理，从而引起膜电位的变化。通过该指示剂的荧光可测量钙水平，同时将记录电极插入细胞以测量膜电位的变化。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 大脑动脉的解剖与分离

注意：所有解剖操作均需通过体视显微镜进行样本放大（最高达50倍），并使用光纤光源提供照明。为完成脑组织和动脉的分离解剖操作，应使用经过 sharpened 的解剖器械。用于分离和清理动脉的显微解剖工具包括尖端 sharpened 的精细镊子以及Vannas型解剖剪（刀片长度3至9.5 mm）。

1. 小鼠脑组织的分离
   1. 麻醉一只 C57BL/6 小鼠（3–30 月龄；雄性或雌性） 通过 吸入异氟烷（3%，2–3 分钟），在完全麻醉诱导后立即斩首处死动物。将头部置于含有冷（4 °C）无钙（zero Ca）的培养皿（直径 10 cm，深度 1.5 cm）中²⁺ 在体视显微镜下使用生理盐溶液（PSS）。
   2. 在显微镜下观察，去除颅骨表面的皮肤和毛发，并用冰冷的无钙溶液清除多余血液²⁺ PSS。使用标准解剖剪刀的尖端（例如，24 mm 刀片），从枕骨开始，沿颅骨的鼻骨向上延伸，进行切开。
   3. 使用粗头镊子沿切口小心打开颅骨，并分离结缔组织，以获取带有完整威尔氏环的脑组织。
      注意： 或者，可使用Littauer骨剪来打开颅骨并暴露脑组织。
   4. 用冰冷的无钙液轻轻冲洗分离的脑组织²⁺ 烧杯中用PSS去除血液。将脑腹面朝上置于含有冷解剖液的容器中，以分离脑动脉。图1A).
2. 脑动脉的分离
   注意： 本方案选择大脑后动脉作为脑血管内皮研究的代表性模型。
   1. 使用不锈钢针（直径 0.2 mm，长度约 11–12 mm）将分离的脑组织固定在冰冷的解剖液中，针插入铺有炭粉掺杂硅胶聚合物的玻璃培养皿底部（深度 ≥50 cm）。
   2. 为在解剖过程中保持PSS的低温环境，可使用制冷系统持续循环1:1水-乙二醇混合液来冷却解剖腔。或者，也可将组织置于新鲜冰上进行解剖。
   3. 使用Vannas型显微剪刀和尖端锋利的精细镊子，用显微解剖器械从后交通动脉和基底动脉上分离出大脑后动脉（约0.3至0.5厘米的节段，无轴向张力）图1B）。使用不锈钢针（直径 0.1 mm，长度约 13–14 mm）将分离出的双侧大脑后动脉固定在培养皿的解剖液中（图1C).
   4. 使用尖端锋利的精细镊子小心清除分离出的脑后动脉上的结缔组织图1D）。将完整的动脉切成段（长度1–2 mm），用于酶消化（图1D；插图）。

2. 内皮管的制备与灌流

1. 使用配备物镜（10x、20x 和 40x）、相机以及可固定腔室和显微操作器的铝制载物台的显微镜准备匀浆装置。将带有泵控制器的微量注射器固定在载物台及样本旁边（图 2A）。
2. 用矿物油完全填充匀浆移液管，并将其固定在微量注射器活塞上方。然后，使用带泵控制器的微量注射器将解离液吸入移液管中（约 130 nl），位于矿物油上方，同时确保移液管内无气泡。
3. 将完整的动脉节段放入盛有 1 mL 解离液的 10 mL 玻璃试管中（图 2B），解离液包含 0.31 mg/mL 木瓜蛋白酶、0.5 mg/mL 二硫赤藓醇、0.75 mg/mL 胶原酶和 0.13 mg/mL 弹性蛋白酶。在 34 °C 下孵育 10–12 分钟以进行部分消化。
4. 消化完成后，用约 5 mL 新鲜解离液替换酶溶液。使用 1 mL 移液器将一段动脉转移至含有解离液的室温（RT）腔室中。
5. 将移液管插入腔室中的解离液，并将其置于消化后血管的一端附近。在泵控制器上设定 2 至 5 nL/s 范围内的流速，进行轻柔匀浆（图 2C；插图）。
6. 在 100x 至 200x 放大倍数下观察，反复吸取和推出动脉节段以解离平滑肌细胞，同时形成内皮管。如有必要，可小心使用尖头镊子将已解离的外膜和内弹性膜从内皮管上分离。确认所有平滑肌细胞均已解离，仅剩完整的“管状”内皮细胞结构（图 2C）。
7. 使用显微操作器，借助硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在灌流腔室的玻璃盖玻片上（图 2D）。
8. 冲洗腔室以去除解离的外膜和平滑肌细胞，并用含 2 mM CaCl₂ 的 PSS 替换解离液。将固定好内皮管的可移动平台转移至灌流与实验装置的显微镜下。
9. 实验过程中根据需要使用 6 个洁净的 50 mL 储液瓶（图 3A），用于持续输送 PSS 及相应的药物溶液。使用串联式流量控制阀手动调节流速，使其始终保持层流状态，并使进液流速与真空抽吸相匹配。在记录背景数据和染料加载前，先向腔室输送 PSS（图 3B）对内皮管进行灌流，时间不少于 5 分钟。

3. 染料加载、洗脱及温度设置

1. 开启光度测量系统的全部组件，用于测量[Ca²⁺]_i。使用实验装置上的显微镜（图3C），以400倍放大倍率观察内皮管，并利用光度测量系统软件套件将焦点对准光度测量窗口中的细胞。
2. 测量内皮管的直径，并在340 nm和380 nm交替激发（≥10 Hz）条件下，记录510 nm发射波长下的背景自发荧光值。
3. 为测量细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]_i）反应，将内皮管加载Fura-2 AM染料（Fura-2-乙酰氧基甲酯，终浓度10 µM），在室温下避光孵育约30–40分钟。
4. 用新鲜的PSS重新开始对内皮管进行灌流，持续约30–40分钟，以洗去多余的染料，并使细胞内的Fura-2 AM完成去酯化。在洗脱期间，使用温度控制器（图3A）配合管路加热器，将温度从室温逐步升至37 °C，之后在整个实验过程中维持在37 °C。
   注意：建议从室温升至37 °C采用分步升温方式（例如每步5 °C），每步至少平衡5分钟。

4. 同时测量[Ca²⁺]_i和V_m

1. 打开所有其他设备及用于测量膜电位（V）的静电计软件套件_m 见 图3, 图4）。相应调整数据采样率（≥10 Hz）。
2. 拉制尖锐电极，并用2 M KCl回填。若需通过染料传递研究细胞间耦合，则将微电极用含0.1%碘化丙啶的2 M KCl溶液回填。
3. 将电极固定在连接于电位计头部的移液器架上，电极内为涂有氯化物的银丝。通过显微操作器操控，将电极尖端短暂置于腔室中流动的PSS内，同时通过4倍物镜观察。
4. 设定静息 V_m 调零，以确保与接地浴液电位一致。将电极尖端置于内皮管的一个细胞上方。如需要，可使用与电表相连的可听基线监测器，将声音音调与电位记录相对应。
5. 将放大倍数调至400倍，使用40倍物镜，并根据需要重新调整电极尖端的位置。通过光度测量软件调节光度窗口，使其聚焦于约50至80个内皮细胞。
6. 使用显微操作器将电极轻轻置入内皮管的一个细胞中，静置 ≥2 分钟以等待静息电压 V_m 以稳定。同样，将第二个电极插入另一个细胞（与第一个电极穿刺的细胞距离≥100 µm）。
7. 静息状态后_m 在无光条件下，于荧光界面开启光电倍增管（PMT），当膜电位稳定于预期值（-30 至 -40 mV）时，开始采集细胞内 [Ca²⁺]_i 通过在510 nm处采集荧光发射信号的同时，交替（10 Hz）激发Fura-2在340 nm和380 nm处的吸收。
   注意： 为检测细胞间电耦合，可施加电流（±0.5–3 nA，脉冲持续时间约20 s） 通过 将一个静电计标记为“Site 1”，并记录V的变化_m 可用另一台静电计记录为“位点2”（距离 ≥100 µm）。
8. 一旦完成V的同步测量_m 和 [Ca²⁺]_i 建立后，以PSS在恒定层流流速下灌流内皮管约5分钟，然后施加药物。
9. 将用PSS配制的药物（例如，三磷酸腺苷[ATP]）以恒定流速加入灌流室。约3分钟后（或根据药物动力学选择适当时间），用PSS冲洗直至V_m 以及 F₃₄₀/₃₈₀ 比率恢复至基线水平。在每次溶液转换过程中，标记光度计和电计软件套件中的相应记录为时间同步。
10. 实验结束后，使用显微操作器将电极从细胞中撤出，并观察 V_m 以浴电极为参考，约为0 mV。停止相应的V记录_m 和 [Ca²⁺]_i 并将记录保存归档以供数据分析。

结果

图1：从脑组织中分离脑动脉 (A) 用解剖液分离出带有完整动脉的大脑（白色箭头指示大脑后动脉）。B) 大脑后动脉的放大视图（白色箭头；约3倍于 vs. 图A）。C用不锈钢针将分离的后脑动脉固定在标本皿中。D去除结缔组织后的脑后动脉。插图显示动脉的切割段；比例尺 = 500 µm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
胶原酶（H型混合物）	Sigma	C8051
二硫苏糖醇	Sigma	D8255
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
弹性蛋白酶	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
碘化丙啶	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM 染料	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
循环冷却器（Isotemp 500LCU）	ThermoFisher Scientific	13874647
聚甲基丙烯酸甲酯灌流室	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
玻璃盖玻片底（2.4 × 5.0 cm）	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
阳极氧化铝平台（直径：7.8 cm）	Warner Instruments	PM6 或 PH6
紧凑型铝制载物台	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
显微操作器	Siskiyou	MX10
体视显微镜	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
光纤光源	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
尼康倒置显微镜	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
相差物镜	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
荧光物镜	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) 和 40X (Plan Fluor)
尼康倒置显微镜	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
微量注射泵控制器（Micro4）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
防振台	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
放大器	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
前置放大器	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
函数发生器	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
数据采集系统	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
可听基线监测器	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
数字存储示波器	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
荧光系统接口、ARC 灯 + 电源、Hyperswitch、PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
温度控制器	Warner Instruments	TC-344B 或 C
管路加热器	Warner Instruments	SH-27B
阀门控制器	Warner Instruments	VC-6
管路流量控制阀	Warner Instruments	FR-50
电子拉制仪	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 或 P-1000
微电极抛光仪	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
硼硅酸盐玻璃管（匀浆用）	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
硼硅酸盐玻璃管（固定用）	Warner Instruments	G150T-6
硼硅酸盐玻璃管（尖电极用）	Warner Instruments	GC100F-10
注射器滤器（0.22 µm）	ThermoFisher Scientific	722-2520
玻璃培养皿 + 活性炭 Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
范纳斯剪刀（3 mm & 9.5 mm）	World Precision Instruments	555640S, 14364
剪刀（3 mm & 7 mm 刀片）	Fine Science Tools (或 FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
锋利尖头镊子	FST	Dumont #5 & Dumont #55