利用电生理记录评估共培养体系中的神经连接形成

摘要

来源：Su, C. T. E.，等。一种评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了通过电生理记录来评估iPSC来源的神经元与大鼠皮层神经元之间的神经连接，通过激活光敏离子通道并检测突触后电流，在共培养体系中证实了突触接触的存在。

方案

1. 诱导多能干细胞来源神经元的电生理记录

1. 确认人iPSCs是否表现出成熟神经元的特性。
   1. 使用配备60倍（0.9 NA）水浸物镜的直立共聚焦显微镜，通过观察tdTomato荧光来识别由人iPSCs分化而来的细胞。
   2. 将记录电极拉制至电阻为4至6 MΩ。在室温下用持续通入95% O₂/5% CO₂的外部溶液灌流细胞，并用内部溶液填充记录微电极。
   3. 对tdTomato阳性细胞进行全细胞膜片钳记录，在电流钳模式下通过注入电流（持续1秒，步长10 pA）记录动作电位的发放情况。
2. 确认表达ChR2的皮层细胞的动作电位是否可被光刺激可靠诱发。
   1. 在共聚焦显微镜下通过观察GFP荧光来识别表达ChR2的皮层细胞，并参照步骤1.1.2至1.1.3对这些皮层细胞进行全细胞膜片钳记录。
   2. 使用100 W汞灯进行光照刺激，验证动作电位是否能够被可靠诱发。激发滤光片的波长为480/40 nm。
3. 进行光遗传学刺激。
   1. 对tdTomato阳性细胞进行全细胞膜片钳记录，将电压钳制在-70 mV。电流信号以2 kHz滤波，10 kHz采样。记录过程中监测串联电阻，保持其在10至20 MΩ范围内稳定。
   2. 使用100 W汞灯配合480/40 nm激发滤光片，对整个视野进行30秒的光刺激。
   3. 记录由表达ChR2的突触前皮层神经元经光刺激后所诱发的被钳制细胞的突触后电流（PSCs），并对PSCs进行检测和测量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P5405
NaHCO3	Sigma	S5761
NaH2PO4	Fluka	71505
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
D(+)-葡萄糖	Sigma	G7520	用于电生理学研究
K-葡萄糖酸盐	Sigma	P1847
KOH	KANTO Chemical	3234400
HEPES	Sigma	H3375	用于电生理学研究
EGTA	Sigma	E3889
Na2ATP	Sigma	A7699
Na3GTP	Sigma	G8877
硼硅酸盐玻璃毛细管	World precision instruments, Inc	1604323
汞短弧灯	OSRAM	HBO 103 W/2