成像腹侧海马轴突在突触共培养中尼古丁诱导的钙信号传导

摘要

来源：Zhong, C., 等，尼古丁诱导腹侧海马轴突钙信号传导及神经递质释放的活体成像。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了尼古丁如何通过激活小鼠腹侧海马体中的烟碱型乙酰胆碱受体，引起轴突上持续的钙信号传导。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 钙成像

1. 冲洗培养物（5 - 7天 体外用正常HBS快速冲洗，然后用5 µM Fluo-4 Ca²⁺ 指示剂（AM酯）和0.02% Pluronic F-127溶于HBS（2 ml）中，37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟₂.
2. 用 HBS 洗去 Fluo-4 溶液（每次 5 分钟，共 3 次）。将培养物放回培养箱（37 °C / 5% CO₂）中继续孵育。₂至少 30 分钟。
3. 在成像腔室中培养（体外培养5-7天），并将腔室安装于转盘共聚焦显微镜上。在室温下以每分钟1毫升的速度持续灌注HBS混合液。
4. 使用平场复消色差物镜（60倍水镜，数值孔径1.4，激发波长488 nm，发射波长530 nm）和CCD相机，采集来自vHipp脑片轴突投射的Fluo-4荧光图像。
5. 采集基线 Fluo-4 荧光图像（每 10 秒一次，持续 2 分钟），作为尼古丁前对照。通过快速灌注（2 ml/min）施加尼古丁（1 µM）持续 1 分钟，随后用 HBS 混合液洗脱尼古丁。在尼古丁施加前、施加期间及施加后，持续每 10 秒采集一次时间序列图像，总时长 30 分钟。
6. 保存原始Fluo-4荧光图像的所有帧，并将其导出为一系列TIFF图像以供进一步分析。
7. 在尼古丁施加前后，采集vHipp轴突上fluo-4荧光的积分强度。
8. 使用以下公式对整合荧光强度进行归一化：ΔF/F₀ =  (F-F₀)/F₀，其中 F₀ 是经背景校正后的尼古丁前整合荧光强度，F 是尼古丁施加后各时间点沿vHipp轴突的整合荧光强度。分析并绘制归一化的整合荧光强度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于活体成像的 HBS 混合液，pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
Magnesium chloride	Sigma	M8266	1 mM
Calcium chloride	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
Tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
Bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM