研究延长性去极化后电位（PDA）在 果蝇 光感受器

摘要

来源：Gutorov, R., 等 用于测量光敏色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器。 视频实验杂志 (2022).

本视频展示了一种用于研究白眼Drosophila中持续性去极化后电位（PDA）的实验方案。通过将果蝇的眼睛暴露于强烈的蓝光脉冲下，使感光色素视紫红质转化为高视紫红质，从而启动信号级联反应，打开阳离子通道并引起膜去极化。由于蓝光会阻止高视紫红质重新转化为视紫红质，阳离子持续内流导致去极化状态长期维持，这种现象称为持续性去极化后电位（PDA）。

方案

1. 利用视网膜电图测量持续性去极化后电位（PDA）

1. 适合的饲养条件 黑腹果蝇 制备
   1. 提升 D. melanogaster 将果蝇饲养于含有标准黄色玉米培养基的瓶子中，置于温度为24 °C、12小时黑暗/12小时光照循环的培养箱内。
   2. 实验前至少将果蝇培养瓶置于黑暗环境中24小时。
2. 通用设置
   1. 使用1 mm × 0.58 mm（外径 × 内径）含纤维的硼硅酸盐玻璃毛细管制备记录电极图1L，O). 玻璃微电极的电阻应为5-10 MΩ；可使用任何合适的拉制仪。
   2. 将两根银丝镀上氯化银₂，将0.25 mm的银丝插入与自制5 V电源相连的3 M KCl溶液中。
   3. 将每根包被的银丝插入电极插槽中（图1N).
   4. 用过滤后的林格氏液填充玻璃毛细管（参见 表1）使用细长喷嘴注射器（图1M).
   5. 将金属丝电极插入玻璃毛细管中，确保毛细管内的溶液与银丝接触。
   6. 插入电极架（图 2P，N）放入双电极显微操作仪中（图2G).
3. 准备果蝇进行电生理记录的操作步骤
   ​注意： 为保持果蝇处于暗适应状态，后续步骤中仅使用微弱的红光照明。
   1. 用CO₂麻醉瓶中的果蝇₂ 使用果蝇睡眠监测系统检测气体图1A、B）并倒入睡眠舱容器中。
   2. 选取一只果蝇，用尖头镊子小心地夹住其翅膀。用培养皿盖住其余的果蝇。
   3. 将果蝇以正确方向放置在果蝇固定装置上——侧躺，背部朝向手部图1P).
   4. 打开电烙铁的电源，将电流调至约 2.25 A。该电流可将 0.25 mm 的铂铱合金丝加热至约 55–56 °C。
   5. 在烙铁上放置一滴低熔点（约55–56 °C）的石蜡图1F).
   6. 使用镊子夹住果蝇的翅膀将其提起，并将其翅膀固定在果蝇固定装置上（图1I使用电烙铁。
   7. 使用电烙铁，用蜡将果蝇的背部固定在支架表面图1P).
   8. 将焊笔尖端下压至引脚连接处，熔化石蜡以同时覆盖所有引脚（图1P).
   9. 在颈部头后方与背部之间放置一小滴蜡图1P).
      ​注意： 特别注意避免果蝇头部过热。确保果蝇被妥善固定，在实验过程中无法移动；轻微的移动可能在记录中产生伪迹。确保胸部和腹部的气管开口（呼吸入口）未被石蜡覆盖。
   10. 将果蝇固定器放置（图 2Q) 置于磁力架上的暗室法拉第笼中图 2I）并确保果蝇距离导光管末端约5 mm（图 2L).
   11. 将记录电极放置于（图2P）位于果蝇眼睛上方以及接地电极（图2N使用显微操作器将电极置于果蝇背部上方。
   12. 使用显微操作器将接地电极插入果蝇的背部。
   13. 使用显微操作器将记录电极插入果蝇复眼的外周区域。
       注意： 将电极插入眼内后，可观察到一个微小的凹陷；此时应向上轻拉电极，但不将其从眼内抽出，直至凹陷消失。电极也可浸入涂抹于躯干和眼部的小滴电极凝胶中。
4. PDA 实验方案（该方案仅适用于白眼果蝇）
   1. 使用橙色滤光片（590 edge滤光片）给予5秒最大强度的光脉冲（以将最大量的光敏色素转化为R态）。
   2. 将橙色滤光片更换为宽波段蓝色滤光片（BP450/40 nm），并在最大强度下给予三次持续5秒的光脉冲。
      ​注意： 也可以给予一个长时间的连续最大强度蓝光脉冲，直至达到稳态电压反应。
   3. 在暗处等待60秒，将蓝色滤光片换回先前的橙色滤光片，给予两次5秒的光脉冲，间隔60秒。

表1：任氏液的成分

林格氏液
试剂	浓度 (mM)
NaCl	130
KCl	2
MgCl2	5
CaCl2	2
HEPES	10
使用 NaOH 和 HCl 将 pH 滴定至 7.15

结果

图 1：果蝇固定及记录电极制备所需的工具与设备。（A）果蝇麻醉系统；（B）果蝇麻醉系统脚踏开关；（C）冷光源；（D）体视显微镜；（E）蜡丝加热器；（F）电烙铁；（G）蜡丝加热器脚踏开关；（H）粗镊子；（I）磁性果蝇固定架；（J）低熔点蜡；（K）精细擦拭纸；（L）垂直电极拉制仪；（M）带细长喷嘴的注射器；（N）电极夹持器；（O）硼硅酸盐玻璃毛细管；（P）固定的果蝇。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带细长尖端的1 mL注射器			图1M
1把粗镊子		Dumont #5，标准型	0.1 mm × 0.06 mm，长度110 mm，不锈钢材质（图1H）
2个聚光镜
A/D转换器	Molecular Device	Digidata 1200	可替代型号：Molecular Devices生产的任意Digidata设备（例如1440A）— 图2C
放大器	Almost perfect electronics		可替代型号：Warner Instruments - IE251A 或 IE-210（含前置放大头级）— 图2D
防震台	Newport	VW-3036-OPT-01	图7H
毛细管	Harvard Apparatus	硼硅酸盐玻璃毛细管	1 mm × 0.58 mm（图1O）
Clampex	Molecular Device		软件
CO2气瓶
冷光源	Schott	KL1500 LCD	图1C
精细擦拭纸	Kimtech		Kimwipes（图1K）
电极夹持器			适用于外径为1 mm的毛细管（图1N、图2N和图2P）
法拉第笼	自制		用于电磁噪声屏蔽，并配有黑色前帘（图2K）
滤光片（彩色）	Schott	OG590，边缘滤光片	图2S
滤光片（彩色）	Schott	BP450/40 nm	图2S
滤光片（彩色）	Blazers	550 nm	图2S
冷光源用滤光片（彩色）	Schott	RG630	图1C
滤光片（热滤光）	Schott	KG3	图1S
滤光片（中性密度滤光片）	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	图2S
闪光灯系统	Honeywell		图2U
带注射装置的果蝇麻醉系统	Inject + matic		图1A-B
灯电源	PTI	LPS-220	图2W
光探测器	自制		光电晶体管（图2O）
导光管			直径3 mm，长1.3 m（图2L,M）
光源			高压无臭氧75 W氙灯（工作功率50 W），可替代型号：Cairn Research - OptoLED（图7R）
低温熔蜡	自制		由蜂蜡（Tm≈62 °C）与石蜡按约3:1比例混合制成，使其熔点约为55–56 °C（图6J）
果蝇用磁性支架	自制		图1I和图2Q
带前置放大头级的微电极放大系统	Almost perfect electronics		阻抗测试仪（图2G）
显微操作器（机械粗调）	Tritech Research, Narishige	M-2
显微操作器（机械微调）	Leitz Microsystems	Leitz机械式显微操作器	图2F
pCLAMP	Molecular Device		软件
培养皿			60 mm
脉冲发生器	AMPI	Master 8	图2A
心电图用导电乳膏	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
快门驱动器	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 单通道单稳态	图2V
快门系统	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm 单稳态快门	图2V
银丝	Warner Instruments		直径0.25–1 mm，需氯化处理
由铂铱丝制成的电烙铁			直径0.25 mm（图2F）
体视变倍显微镜	Nikon	SMZ-2B	图1D
体视变倍显微镜	Wild	Wild M5	具备6、12、25和50倍放大设置（图2E）
注射器滤器	Millex		22 µm PVDF滤膜
垂直拉针仪	Sutter/ Narishige	型号P-97/PP-830	可根据需要选用垂直或水平拉针仪（图1L）
蜡丝加热器	自制		图1E-G
氙气闪光灯系统	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	图2X