杏仁核脑切片中神经元通路的可视化和映射

Abstract

来源:Bosch， D. 等人 脑切片中恐惧回路的体外光遗传学解剖。J. Vis. Exp. （2016 年）。

该视频演示了使用小鼠急性杏仁核脑切片分析内侧前额叶皮层 （mPFC） 和杏仁核神经元之间的突触连接的程序。这些小鼠中的 mPFC 神经元表达与荧光蛋白融合的通道视紫红质。通道视紫红质在光激活后促进离子内流和 mPFC 神经元中动作电位的产生。因此，mPFC 神经元释放与突触后杏仁核神经元结合的神经递质，触发突触后电流，这些电流被记录下来以可视化 mPFC-杏仁核连接。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 突触前纤维的可视化和刺激

1. 准备用于纤维和细胞的光遗传学激活的贴片显微镜:
   1. 将安装的发光二极管 （LED） 置于光传输路径的中心。
   2. 使用功率计测量后焦平面和每个物镜输出端的 LED 光强度，选择合适的 470 nm 波长。
   3. 计算以 mW/mm² 为单位的光强度，并为每个物镜创建校准曲线（LED 强度 （%） 与光输出 （mW/mm²）），用于 470 nm 波长的测量值。
2. 从界面室中取出急性杏仁核切片，并放置在安装在配备荧光灯的正置显微镜上的切片室中。注意放置切片，使界面室中朝上的切片表面在记录室中也朝上。在 ~31 °C 的温度下，以 1 - 2 ml/min 的速率灌注新鲜的含氧人工脑脊液 （ACSF） 切片。
3. 使用荧光灯结合针对表达的特定荧光蛋白的适当滤光片组观察切片中的突触前纤维。使用 5 倍物镜获得概览（图 1E），使用 60 倍物镜评估目标区域内的纤维密度。
   注意:对于 GFP 和 YFP，使用"绿色"滤光片组（激发 472/20、分光镜 495、发射 490 LP），对于 mCherry，使用"红色"滤光片组（激发 560/40、分光镜 585、发射 630/70），如材料/设备表中指定。
4. 根据实验的需要打开或限制显微镜光路中的孔径（图 2D）。
5. 要获得补片记录，请用内部溶液填充补片移液器并将其安装在电极支架中。对贴剂移液管施加正压，然后慢慢降低，首先将其降低到浴液中，然后在视觉控制下使用显微作器进入切片。
   1. 用贴片移液器从侧面和顶部接近感兴趣的神经元。当移液器位于细胞表面时（细胞表面可见酒窝）释放正压，并通过施加负压获得"gigaseal"。
   2. 进一步抽吸以破坏膜贴以获得全细胞记录。随后，使用适当的波长用连接的 LED 刺激标记的纤维，以激活通道视紫红质 （ChR） （470 nm），同时记录来自细胞的电响应。
   3. 对于突触刺激，从低 LED 强度开始，然后增加直到达到所需的突触电流幅度。通过在数据采集软件中配置数字输出来触发 LED，以控制时序和脉冲长度（图 3 中的示例）。
      注意:可以使用其他软件和/或 TTL 生成设备来触发 LED。
根据需要，在
6. 显微镜光路中用开放或受限孔径（步骤 1.4）重复刺激，以用于下一个记录的细胞和/或在存在特定药物的情况下。

Results

图 1.立体定向注射、急性脑切片的制备和突触前纤维的可视化。（一、二）立体定向病毒注射。A） 将麻醉小鼠放置在立体定向框架中，颅骨暴露且注射移液管的图片。插图:注射移液管的放大图片，其中填充了与固绿混合的病毒溶液。比例尺:3 毫米。（B） 小鼠头骨的示意图，其中标记了不同注射区域的钻孔位置。（C） 显示本研究中使用的不同病毒构建体的方案。深灰色:启动子序列;蓝色:通道视紫红质 2 （ChR2 （H134R））;绿色/红色:荧光蛋白。局部杏仁核投影的表达时间为 2 周，mPFC 和 MGm/PIN 投影的表达时间为 4 - 6 周。（D） 急性脑切片的制备:显示小鼠大脑放置在切片机阶段的方案，用于从不同的注射和投影区域获得切片。（E） 在 ...

Materials