杏仁核脑切片中神经元通路的可视化与定位

摘要

来源：Bosch, D., 等 离体 光遗传学解析脑切片中的恐惧环路 视频实验杂志 (2016).

本视频演示了一种利用小鼠急性杏仁核脑片分析内侧前额叶皮层（mPFC）与杏仁核神经元之间突触连接的方法。这些小鼠的mPFC神经元表达与荧光蛋白融合的光敏通道蛋白。在光照激活下，光敏通道蛋白可促进离子内流并引发mPFC神经元产生动作电位。随后，mPFC神经元释放神经递质，与杏仁核突触后神经元上的受体结合，触发突触后电流，通过记录这些电流可可视化mPFC-杏仁核之间的连接性。

方案

所有涉及动物样本的操作均经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 突触前纤维的可视化与刺激

1. 准备用于光遗传学激活纤维和细胞的膜片钳显微镜：
   1. 将安装好的发光二极管（LED）对准光传递路径的中心。
   2. 使用功率计在后焦平面以及每个物镜输出端测量LED光强，选择适当的波长470 nm。
   3. 计算以mW/mm²为单位的光强，并为每个物镜在470 nm波长下测得的数值绘制校准曲线（LED强度（%）相对于光输出（mW/mm²））。
2. 从界面式孵育槽中取出急性杏仁核脑片，置于直立显微镜上的记录槽内，该显微镜配备有荧光光源。注意放置脑片时，应使其在界面式孵育槽中朝上的表面在记录槽中仍保持朝上。用新鲜、充氧的人工脑脊液（ACSF）以1 - 2 ml/min的流速灌流脑片，温度维持在约31 °C。
3. 结合使用荧光光源和适用于所表达的特定荧光蛋白的滤光片组，在脑片中观察突触前纤维。使用5倍物镜进行整体观察（图1E），使用60倍物镜评估目标区域内的纤维密度。
   注意：对于GFP和YFP，使用“绿色”滤光片组（激发光472/20，分光镜495，发射光490 LP）；对于mCherry，使用“红色”滤光片组（激发光560/40，分光镜585，发射光630/70），具体参见材料与设备表中的说明。
4. 根据实验需要，打开或限制显微镜光路中的孔径光阑（图2D）。
5. 进行膜片钳记录时，用细胞内液填充膜片钳电极，并将其安装至电极夹持器中。向膜片钳电极施加正压，然后通过显微操作器先缓慢将其插入浴液，再在视觉控制下插入脑片。
   1. 从侧面和上方接近目标神经元。当电极接触细胞表面（细胞表面可见凹陷）时释放正压，并通过施加负压形成“吉欧封接”（gigaseal）。
   2. 进一步施加负压以破裂膜片，获得全细胞记录模式。随后，使用连接的LED以激活通道视紫红质（ChR）的适当波长（470 nm）刺激标记的纤维，同时记录细胞的电反应。
   3. 进行突触刺激时，从低LED强度开始，逐步增加至达到所需的突触电流幅度。通过数据采集软件设置数字输出信号，以控制LED的触发时机和脉冲持续时间（示例见图3）。
      注意：也可使用其他软件和/或TTL信号发生设备来触发LED。
6. 根据下一个记录细胞的需要，或在特定药物存在的情况下，重复进行在打开或限制显微镜光路孔径（步骤1.4）条件下的刺激实验。

结果

图1. 立体定位注射、急性脑切片制备及突触前纤维的可视化。 （A, B）立体定位病毒注射。A）小鼠在立体定位仪中的照片，小鼠已麻醉，颅骨暴露，并插入注射移液管。插图：充满病毒溶液与快绿染料混合液的注射移液管的放大图像。比例尺：3 mm。（B）小鼠颅骨示意图，标示了不同注射区域钻孔的位置。（C）本研究所用的不同病毒载体示意图。深灰色：启动子序列；蓝色：通道视紫红质2（ChR2 (H134R)）；绿色/红色：荧光蛋白。局部杏仁核投射的表达时间为2周，mPFC和MGm/PIN投射的表达时间为4–6周。（D）急性脑切...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液（ACSF）	成分见参考文献 #16 和 #23
膜片钳内部溶液	成分见参考文献 #16 和 #23
七水合硫酸镁	Roth, 德国	P027.1	用纯水配制 2M 储存液
体视显微镜，SZX2-RFA16	Olympus, 日本
Xcite 荧光灯（XI120Q-1492）	Lumen Dynamics Group, 加拿大	2012-12699
膜片钳显微镜，BX51WI	Olympus, 日本
Multiclamp 700B 膜片钳放大器	Molecular Devices, 美国
Digitdata 1440A	Molecular Devices, 美国
PClamp 软件，版本 10	Molecular Devices, 美国		用于控制数据采集和刺激
浴槽温度控制器，TC05	Luigs & Neumann, 德国	200-100 500 0145
三轴微操纵器 Mini 25	Luigs & Neumann, 德国	210-100 000 0010
微操纵器控制器 SM7	Luigs & Neumann, 德国	200-100 900 7311
膜片钳玻璃毛细管	World Precision Instruments, 德国	GB150F-8P
界面式记录室用硝酸纤维素滤纸	Satorius Stedim Biotech, 德国	13006--50----ACN
LED 光源单元，CoolLED pE	CoolLED, 英国	244-1400	CoolLED 或 USL 70/470 及相应适配器是 LED 刺激的两种可选方案
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, 英国	pE-ADAPTOR-50E
LED 光源单元，USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000
双端口适配器	Rapp Optoelectronic	向公司咨询
红色滤光片组（激发）	AHF, 德国	F49-560	滤光片可作为 F46-008 套装购买
（分光镜）	AHF, 德国	F48-585
（发射）	AHF, 德国	F47-630
绿色滤光片组（激发）	AHF, 德国	F39-472	替代方案：滤光片组 F36-149 或 F46-002（带通发射）
（分光镜）	AHF, 德国	F43-495W
（发射）	AHF, 德国	F76-490
LaserCheck 手持式功率计	Coherent, 美国	1098293
IgorPro 软件，版本 6	Wavemetrics, 美国		用于电生理数据分析，也可使用其他替代软件包
IgorPro 宏工具包 Neuromatic	http://www.neuromatic.thinkrandom.com