大鼠视网膜电图与视觉诱发电位的记录

摘要

来源：Charng, J. 等。清醒大鼠无线视网膜电图与视觉诱发电位的植入与记录。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了如何在清醒大鼠中记录视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）。植入电极的大鼠首先进行暗适应。滴入散瞳液后，将动物放入固定器中，并置于全视野刺激碗（Ganzfeld bowl）内，随后记录ERG和VEP信号。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 电极的制备

注意： 手术植入使用一个三通道发射器，可同时进行2个视网膜电图（ERG）和1个视觉诱发电位（VEP）记录。在植入前，需将三个有源电极和三个无源电极预先制作成环形，以便贴合眼球。为便于识别，制造商将有源电极封装在半白色、半彩色的塑料护套中，而无源电极则包裹在全彩色护套中。所有有源和无源电极的接地电极（透明塑料护套）保持原状不变，用于执行步骤1.1、1.2、1.3和1.7。

1. 使用两把尖头镊子将双股不锈钢电极拧开。
2. 剪去其中一根不锈钢丝（距尖端约1 cm），保留一根较长的直丝用于制作环形电极。
3. 将单根不锈钢丝向自身方向弯折并扭绞，在电极尖端形成一个光滑的环。
4. 对于视网膜电图（ERG）的活性电极，通过扭绞环的基部将其制成直径约0.2–0.5 mm的环（根据此处所述目的，制作两个这样的活性电极以记录双眼的ERG）；对于ERG的非活性电极和视觉诱发电位（VEP）电极，则将环的直径制成约0.8 mm（在本示例中，为一个VEP活性电极和全部三个非活性电极进行此操作）。
5. 将环状VEP活性电极钩在一颗不锈钢螺钉（直径0.7 mm，长度3 mm）上，使电极紧贴螺钉头部。
6. 将3个非活性电极（2个ERG，1个VEP）钩在第二颗不锈钢螺钉（直径0.7 mm，长度3 mm）上。
7. 将塑料套管向前推，覆盖住两根不锈钢丝的尖锐末端，以减少刺激。
8. 将遥测发射器在2%戊二醛溶液中浸泡超过10小时（温度约为25 °C）进行灭菌，随后用无菌生理盐水冲洗三次。

2. 发射器植入

1. 动物准备​
   1. 实验前用70%乙醇清洁手术区域以进行消毒。所有手术器械在使用前需高压灭菌，并在手术过程中不使用时置于氯己定中保存。手术期间用手术巾覆盖动物以维持无菌环境。确保所有操作人员佩戴外科口罩、无菌手套和手术服。
   2. 以3 L/min的流速诱导1.5–2%异氟烷麻醉，并在手术全程以2 L/min维持1.5–2%的麻醉浓度。通过夹捏脚趾间肌肉时无足底反射来确认麻醉深度足够。
   3. 在腹部剃除一个从腹股沟上方至胸骨、大小为40 mm × 30 mm的区域。
   4. 在前额部剃除一个位于眼睛后方至耳朵前方、大小为30 mm × 20 mm的区域。
   5. 对上述两个剃毛区域进行消毒。前额区域使用10%聚维酮碘消毒三次（避免在眼部附近使用含酒精的消毒剂，应符合手术技术人员协会制定的标准操作规范）。腹部区域则使用10%聚维酮碘和70%乙醇进行消毒。
   6. 向角膜滴加1滴丙氧麻卡因，以提供额外的局部麻醉。
   7. 向角膜滴加1滴羧甲基纤维素钠，防止眼睛干燥。
2. 手术植入
   1. 使用手术刀在两耳之间的头部正中垂直线上做一个10 mm长的切口。
   2. 在胸骨下方腹中线处通过皮肤层做一个5 mm长的腹部切口。
   3. 从腹部切口至头部切口皮下穿入一根直径为5 mm的套管。
   4. 将发射器的电极导线（3根主动电极和3根非主动电极）通过套管从腹部引至头部。
   5. 将参考电极留在发射器基座处，并用无菌纱布覆盖电极尖端。
   6. 用无菌纱布覆盖所有电极尖端（3根主动电极和3根非主动电极）。
   7. 将大鼠头部固定于立体定位仪平台上。
   8. 用手术剪将前额切口延长至30 mm。
   9. 使用两根缝线（3-0）在约3点和9点位置牵拉松动皮肤，暴露手术区域。
   10. 用灭菌纱布刮除颅骨表面的骨膜，暴露前囟、后囟及颅骨中线缝合线。
   11. 在视觉诱发电位（VEP）主动电极（前囟腹侧7 mm，中线外侧3 mm）和非主动电极（前囟头侧5 mm，位于中线上）的立体定位坐标处钻穿颅骨形成两个孔。
   12. 使用小型螺丝刀将预装的不锈钢螺丝（直径0.7 mm，长度3 mm）分别固定于VEP主动和非主动电极位置，旋入预先钻好的孔中约1 mm深度。此操作可将螺丝锚定于骨组织中，同时避免损伤下方的皮层组织。
   13. 为植入视网膜电图（ERG）主动电极，使用8-0缝线暂时牵拉上眼睑。
   14. 从眼球后方皮下插入16–21 G套管，通向结膜上穹窿。
   15. 取出引导针。
   16. 将主动电极通过缩短的塑料导管从前额向眼部方向送入，随后移除塑料导管。
   17. 使用一根穿过电极环的临时缝线（8-0），防止电极回缩至隧道内。
   18. 在12点方向、距角膜缘后方1 mm处的上方结膜做0.5 mm切口。采用钝性分离暴露下方巩膜。
   19. 在角膜缘后方立即植入一根8-0或9-0缝线，深度约为巩膜厚度的一半。
   20. 移除ERG主动电极上的临时缝线。
   21. 通过打三个连续结，将ERG主动电极固定于巩膜半厚度缝线上，确保电极尖端靠近角膜缘。
   22. 使用1–2个间断缝合（8-0至9-0）闭合结膜瓣。确保结膜完全覆盖ERG电极，以提高动物舒适度。
   23. 移除眼睑牵开缝线。
   24. 对对侧眼重复上述操作。
   25. 在颅骨上涂抹氰基丙烯酸酯凝胶，以固定所有不锈钢螺丝和电极导线。固定前确保ERG主动电极不过紧，以便保留眼球运动能力。
   26. 使用不可吸收的3-0缝线闭合头部切口。
   27. 将啮齿类动物翻转以暴露腹部区域。用手术剪沿腹白线将腹部皮肤切口延长至40 mm。
   28. 在内层肌壁上做35 mm切口，暴露腹腔内部。
   29. 使用两根缝线（3-0）将发射器本体固定于动物右侧腹腔内壁。避免接触肝脏。
   30. 将接地电极弯曲成环状，并用一根缝线（3-0）固定其形状，随后将其自由悬置于腹腔内。
   31. 使用连续缝合（3-0）闭合腹膜。
   32. 使用间断缝合（3-0）闭合皮肤切口。
3. 术后护理​
   1. 持续监测动物直至其恢复足够意识以维持胸卧位。术后将动物单独饲养。
   2. 术后连续4天每天一次皮下注射卡洛芬镇痛（5 mg/kg）。
   3. 术后7天内在饮水中添加预防性口服抗生素（恩诺沙星，5 mg/kg）。
   4. 术后前7天在皮肤切口处涂抹抗炎软膏以减少刺激。

3. 在清醒大鼠中进行视网膜电图和视觉诱发电位记录​

1. 在进行ERG和VEP记录前，将动物暗适应12小时。
2. 所有实验操作均在弱红光照射下进行（17.4 cd·m⁻²，λmax = 600 nm）
3. 在角膜上施用局部麻醉剂（0.5% 丙美卡因）和散瞳剂（0.5% 托吡卡胺）滴眼液。
4. 将清醒的啮齿类动物引导进入定制的透明固定装置中。
   注意： 该塑料管的长度可调节，以适配不同体型的大鼠，整体直径固定为60 mm。装置前端呈锥形设计，以减少头部移动，并设有通气孔以保证正常呼吸。锥形前端有助于将大鼠的头部和眼睛与Ganzfeld球体的开口对齐并固定。请注意，实验前已让啮齿动物适应固定装置3至5次。
5. 将啮齿类动物置于Ganzfeld碗前方，使眼睛与碗的开口对齐。
6. 通过将磁铁置于距离内置发射器约5厘米范围内以开启设备。随后，通过检查接收器底座上的LED状态指示灯，确认发射器是否已开启。
7. 在一系列光能范围内采集信号（即 -5.6 至 1.52 log cd·s·m⁻²）²).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物信号放大器	ADInstruments	ML 135	放大ERG和VEP信号
1.0% 羧甲基纤维素钠	Allergan	CAS 0009000-11-7	手术期间维持角膜水合状态
卡洛芬 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	术后镇痛，与生理盐水注射液合用以补充体液
氯己定 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	手术器械消毒
氰基丙烯酸酯凝胶活化剂	RS components	473-439	快速干燥氰基丙烯酸酯凝胶
氰基丙烯酸酯凝胶	RS components	473-423	将不锈钢螺钉固定于颅骨
牙科钻头	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	直径约0.7 mm的微型钻头，用于在每侧半球颅骨上钻孔以植入VEP螺钉
钻机	Bosch	Dremel 300系列	用于颅骨钻孔的自动钻机
恩诺沙星	Troy Laboratories		术后预防性抗生素
全视野积分球	Photometric Solutions International		定制设计的光刺激器：直径36 mm，孔径13 cm
纱布棉片	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	手术期间干燥手术切口和暴露的颅骨表面
异氟烷 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	商品名：Isoflo(TM) 吸入麻醉剂。药用级吸入麻醉剂，与氧气混合用于VEP电极植入手术
Kenacomb软膏	Aspen Pharma Pty Ltd		减少术后皮肤刺激和瘙痒
Luxeon LED灯	Phillips Lighting Co.		用于光刺激，包含二十个5瓦和一个1瓦LED灯，由Scope软件控制
缝合针（大体手术）	World Precision Instruments	501959	用于腹部和头部手术缝合，配合3-0缝线、圆针、切割刃，5/16圆弧，1号，15 mm
持针器（大体手术）	World Precision Instruments	500224	在腹部和头部手术中夹持缝合针
持针器（显微手术）	World Precision Instruments	555419NT	在眼部手术中夹持缝合针
Optiva导管	Smiths Medical International LTD	16或21 G	引导角膜活性电极从颅骨至结膜
聚维酮碘 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	商品名：Betadine，用于术前皮肤消毒的抗菌剂，10%，500 mL
Powerlab数据采集系统	ADInstruments	ML 785	从遥测发射器获取信号，与遥测数据转换器配对使用
丙美卡因 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	局部眼部镇痛
固定装置	定制制作		固定装置前端呈锥形以减少头部移动，长度可调以适应不同大小的大鼠，整体直径为60 mm
手术刀片	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	用于手术切口
手术剪（大体手术）	World Precision Instruments	501225	用于切割腹部和前额组织
手术剪（显微手术）	World Precision Instruments	501232	用于解剖结膜以安装电极
Scope软件	ADInstruments	版本 3.7.6	通过ADI Powerlab系统同步触发刺激并采集数据
剃毛器	Oster	Golden A5	剃除手术区域的毛发
不锈钢螺钉	MicroFasteners	L001.003CS304	轴径0.7 mm，长度3 mm
立体定位仪	David Kopf	型号 900	用于小型动物颅骨上定位植入标志点的立体定位仪器
手术单	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	确保手术期间的无菌环境
缝合线（大体手术）	Ninbo medical needles	3-0	用于腹部和头部手术缝合，无菌编织丝线，60 cm
缝合针（显微手术）	Ninbo medical needles	8-0 或 9-0	用于眼部手术，包括将电极缝合至巩膜及闭合结膜伤口，尼龙缝线，3/8圆弧 1×5，30 cm
遥测数据转换器	DataSciences International	R08	使遥测信号可与数据采集软件连接
遥测数据交换矩阵	DataSciences International		收集来自发射器的数据，并与接收器配对
遥测数据接收器	DataSciences International	RPC-1	接收来自发射器的遥测数据
遥测发射器	DataSciences International	F50-EEE	三通道遥测发射器
托吡卡胺 0.5%	Alcon Laboratories		瞳孔散大
镊子（大体手术）	World Precision Instruments	500092	在腹部和头部手术中操作组织
镊子（显微手术）	World Precision Instruments	500342	在眼部手术中操作组织