癫痫诱导大鼠癫痫发作的脑电图记录

摘要

来源：Soukupová, M.，等。在自由活动大鼠中进行脑电图记录期间兴奋性氨基酸的微透析。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在诱发癫痫的大鼠中进行癫痫发作的脑电图（EEG）记录。一只在腹侧海马区植入电极的大鼠连接至脑电图记录系统，并置于一个有机玻璃容器中。在记录脑部活动以监测癫痫发作发生情况的同时，允许大鼠自由活动。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微透析探针-电极装置的组装

1. 使用一个三通道双绞电极（记录电极至少具有 20 mm 的暴露长度，接地电极长度为 10 cm），并将其与引导套管连接以制备装置。参见 图 1A-1B 中用于透析的三通道电极和引导套管示例。
2. 在将金属引导套管用于动物实验前，先将其从假塑料套管中取出（图 1C）并重新插入（图 1D）数次，以便在动物体内更换为微透析探针时更容易移除。
3. 将记录电极的双绞导线弯曲两次（图 1E-1F），以使导线与引导套管的假套管对齐，并使用数字卡尺将电极尖端（图 1G）裁剪至比引导套管尖端长 0.5 mm（图 1H）。
4. 准备好一段长 1 mm 的硅胶环（外径 [O.D.] 2 mm，厚度 0.3 mm；图 1I），用镊子将引导套管尖端和双绞电极尖端插入硅胶环中（图 1J）。使用快速作用的聚合物胶水或树脂将其固定在引导套管底座的基部（图 1K）。参见 图 1L 和 图 2A 中已完成装置的示例。
5. 在杀菌紫外（UV）光下对装置进行 4 小时的灭菌处理。每隔 1 小时翻转装置一次，共翻转四次，确保每一侧均暴露于紫外光下 1 小时。
   注意：许多自制电极和微透析探针均可采用类似方式组装。上述大鼠用植入装置头部的尺寸如下：从顶部到底座前端为 7 mm 宽 × 5 mm 深 × 10 mm 长；植入体尖端长约 11 mm，直径 600 µm，整个装置重量约为 330–360 mg。若满足以下两个条件，该装置可重复使用两到三次：（i）手术时在颅骨上保留足够长度的接地电极以供下次使用；（ii）动物处死后，连同牙科水泥一起回收装置，并将其置于丙酮中过夜，使水泥可被机械解离，随后对装置进行清洗并再次灭菌。

2. 立体定位手术

1. 使用立体定位仪和探针夹持器（图2B按照现行无菌和无痛手术标准进行设备植入。
   1. 用氯胺酮/赛拉嗪混合物（43 mg/kg 和 7 mg/kg，腹腔注射 [i.p.]）麻醉成年 Sprague-Dawley 大鼠，并将其固定于立体定位仪上。在初始注射氯胺酮/赛拉嗪的基础上，加用异氟烷麻醉（空气中浓度 1.4%；流速 1.2 mL/min），以便及时调控麻醉深度。剃除动物头部的毛发。
2. 用碘溶液擦拭头部皮肤表面，随后使用70%乙醇进行消毒，以准备无菌手术。
   1. 将先前制备的导管-电极装置（1.1 – 1.5）植入右侧腹侧海马，定位坐标如下：鼻棒 +5.0 mm，前囟前 -3.4 mm，右侧 +4.5 mm，前囟后 +6.5 mm。采用标准的立体定位手术技术进行操作。
   2. 确保不要覆盖固定螺钉。将装置安装到立体定位仪时，应握住导管套件头部，以便与探针架轻松对齐。
3. 使用至少四枚不锈钢螺钉将装置固定在颅骨上（一枚拧入左侧、一枚拧入右侧额骨板，一枚拧入左侧顶骨、一枚拧入顶间骨板）。在每枚螺钉处滴加一滴组织胶，以进一步将螺钉固定于颅骨。
   1. 用甲基丙烯酸酯骨水泥覆盖螺钉螺纹的一半。通过在骨头上制作浅槽以增加附着力，促进骨水泥的结合。
4. 将装置的尖端插入脑组织后，将接地电极的导线缠绕在3个固定螺钉上。用牙科水泥覆盖所有已安装的螺钉和装置。
5. 在手术期间及术后约1小时内监测动物，直至其能够直立并在笼内活动。将动物置于加热垫上，以防止低体温。设备植入后，让大鼠至少恢复7天。
6. 术后至少每天观察动物一次，持续3天，以监测疼痛或不适症状。在切口部位附近给予抗生素软膏（庆大霉素 0.1%）以预防感染，并给予镇痛剂（腹腔注射曲马多 5 mg/kg）连续3天，以预防术后疼痛。

3. 匹罗卡品诱导颞叶癫痫及实验动物分组

1. 术后恢复一周后，将动物随机分组：(i) 接受溶剂的对照组动物，以及 (ii) 接受匹罗卡品的癫痫动物。由于并非所有给予匹罗卡品的大鼠都会发病，因此癫痫组的动物数量应按比例增加。
2. 注射甲基东莨菪碱（1 mg/kg，皮下注射 [s.c.]），30 分钟后，单次注射匹罗卡品（350 mg/kg，腹腔注射 [i.p.]）以诱导癫痫持续状态（SE）。对照组大鼠注射甲基东莨菪碱和溶剂（生理盐水）。所有腹腔注射均使用 1 mL 注射器配 25G 针头。
   1. 通过肉眼观察动物是否开始出现行为性癫痫发作（5 分钟内胡须抖动、点头、肢体抽搐），并在 25 分钟内发展为全身持续性抽搐（SE）。
3. 在癫痫持续状态（SE）发作 2 小时后，通过注射地西泮（20 mg/kg，腹腔注射 [i.p.]）终止发作，以实现约 25% 的死亡率，并使平均潜伏期约为 10 天。从匹罗卡品注射后立即开始观察并记录任何癫痫行为，持续至少 6 小时。
4. 在 SE 后 2–3 天内，使用 1 mL 注射器配 25G 针头给予动物生理盐水（1 mL，腹腔注射 [i.p.]），并使用 1 mL 注射器配 17G 柔性喂食针给予蔗糖溶液（1 mL，口服 [p.o.]），以促进体重恢复。
   1. 将匹罗卡品诱导的 SE 后第一周内未能恢复至初始体重的动物排除出研究（急性组除外，该组在 SE 后 24 小时处死，无法进行体重追踪）。
5. 将 SE 后的动物随机分配至不同的实验组（图 3）：急性期（微透析在 SE 后 24 小时进行）、潜伏期（SE 后 7–9 天）、首次自发性癫痫发作期（约 SE 后 11 天）和慢性期（始于 SE 后约 22–24 天，即首次发作后约 10 天）。监测动物是否出现自发性癫痫发作。
   注意：对癫痫大鼠后续实验采用以下纳入/排除标准：在给予匹罗卡品后 1 小时内出现惊厥性癫痫持续状态；SE 后第一周体重增加；微透析探针和电极位置正确。

4. 癫痫行为监测与分析

1. 癫痫行为的长期监测
   1. 在给予匹罗卡品约6小时后（即研究人员直接观察结束后），将动物放入清洁的饲养笼中，并开始24小时视频监测。
   2. 使用数字视频监控系统，持续进行24小时视频监测，直至第5天。
   3. 从第5天开始，将动物在其矩形饲养笼中连接至有缆EEG记录系统，并继续24小时视频监测。
   4. 在法拉第屏蔽室外的放大器上设置参数（根据每只动物EEG信号的特性，分别设置各通道的放大倍数），并通过观察未连接导线时产生的EEG信号开始采集。采样频率设为200 Hz，高通滤波器设为0.5 Hz。
   5. 将动物连接至导线：用一只手的两个伸直手指固定动物头部，另一只空闲的手将连接器旋紧到电极基座上，然后开始信号采集。
      注意：确保信号无伪迹。常见伪迹为远超量程的尖峰信号。
   6. 在进行微透析实验的前一天，将动物转移至配备有机玻璃圆筒的有缆EEG系统中。在饲养笼中，通过将连接器从电极上旋下，使动物脱离EEG连接装置，且不束缚动物，随后将动物放入较高的有机玻璃圆筒中。

结果

图1. 植入装置的逐步制备过程。（A）三通道电极，左侧为其保护套管内的10 cm长接地电极，右侧为用于微透析的引导套管，用于组装该装置。（B）裸露电极与引导套管的细节图。第一步是将金属引导套管从其塑料假体中反复取出（C）和插入（D）数次，以便在植入动物头部后能顺利分离。（E，F）第二步是将扭绞的记录电极弯曲两次，使其与透析引导套管对齐。（G）电极尖端应被剪裁至比金属引导套管尖端长0.5 mm。（H）使用数字卡尺检查剪裁精度。随后，应使用约1 mm长的硅胶环固定电极与引导套管基部的对齐位置（I）。（J）照片显示如何将电极和引导套管轴部套上硅胶环。（K）最后一步是在引导套管基座上滴加一滴树脂或胶水，将硅胶环固定于其上。（L）组装完成的装置， ready ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三通道双绞电极	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	材料
导引套管	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	材料
树脂 KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	材料
Super Attack 胶水 Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	材料
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	溶液
赛拉嗪（Xylazine）	Sigma, Milano, Italy	X1251	材料
异氟烷-Vet（Isoflurane-Vet）	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	溶液
Altadol 50 mg/ml - 曲马多（tramadol）	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	溶液
Gentalyn 0.1% 乳膏 - 庆大霉素（gentamycine）	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	材料
快速型简单牙科水泥（simplex rapid dental cement）	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	材料
玻璃离子 CX-Plus 水泥（GlasIonomer CX-Plus Cement）	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	材料
探针夹持器（probe clip holder）	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	设备
Histoacryl® Blue 皮肤表面粘合剂	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	材料
安定 10 mg/2 ml - 地西泮（diazepam）	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	材料
带 25G 针头的 1 mL 注射器	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	材料
大鼠用柔性饲喂针头 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	材料
Grass Technology 仪器	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40）
模块化数据采集与分析系统 MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	设备
数字视频监控系统	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	设备