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方法文章

癫痫诱导大鼠癫痫发作的脑电图记录

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Soukupová, M.,在自由活动大鼠中进行脑电图记录期间兴奋性氨基酸的微透析J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在诱发癫痫的大鼠中进行癫痫发作的脑电图(EEG)记录。一只在腹侧海马区植入电极的大鼠连接至脑电图记录系统,并置于一个有机玻璃容器中。在记录脑部活动以监测癫痫发作发生情况的同时,允许大鼠自由活动。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微透析探针-电极装置的组装

  1. 使用一个三通道双绞电极(记录电极至少具有 20 mm 的暴露长度,接地电极长度为 10 cm),并将其与引导套管连接以制备装置。参见 图 1A-1B 中用于透析的三通道电极和引导套管示例。
  2. 在将金属引导套管用于动物实验前,先将其从假塑料套管中取出(图 1C)并重新插入(图 1D)数次,以便在动物体内更换为微透析探针时更容易移除。
  3. 将记录电极的双绞导线弯曲两次(图 1E-1F),以使导线与引导套管的假套管对齐,并使用数字卡尺将电极尖端(图 1G)裁剪至比引导套管尖端长 0.5 mm(图 1H)。
  4. 准备好一段长 1 mm 的硅胶环(外径 [O.D.] 2 mm,厚度 0.3 mm;图 1I),用镊子将引导套管尖端和双绞电极尖端插入硅胶环中(图 1J)。使用快速作用的聚合物胶水或树脂将其固定在引导套管底座的基部(图 1K)。参见 图 1L图 2A 中已完成装置的示例。
  5. 在杀菌紫外(UV)光下对装置进行 4 小时的灭菌处理。每隔 1 小时翻转装置一次,共翻转四次,确保每一侧均暴露于紫外光下 1 小时。
    注意:许多自制电极和微透析探针均可采用类似方式组装。上述大鼠用植入装置头部的尺寸如下:从顶部到底座前端为 7 mm 宽 × 5 mm 深 × 10 mm 长;植入体尖端长约 11 mm,直径 600 µm,整个装置重量约为 330–360 mg。若满足以下两个条件,该装置可重复使用两到三次:(i)手术时在颅骨上保留足够长度的接地电极以供下次使用;(ii)动物处死后,连同牙科水泥一起回收装置,并将其置于丙酮中过夜,使水泥可被机械解离,随后对装置进行清洗并再次灭菌。

2. 立体定位手术

  1. 使用立体定位仪和探针夹持器(图2B按照现行无菌和无痛手术标准进行设备植入。
    1. 用氯胺酮/赛拉嗪混合物(43 mg/kg 和 7 mg/kg,腹腔注射 [i.p.])麻醉成年 Sprague-Dawley 大鼠,并将其固定于立体定位仪上。在初始注射氯胺酮/赛拉嗪的基础上,加用异氟烷麻醉(空气中浓度 1.4%;流速 1.2 mL/min),以便及时调控麻醉深度。剃除动物头部的毛发。
  2. 用碘溶液擦拭头部皮肤表面,随后使用70%乙醇进行消毒,以准备无菌手术。
    1. 将先前制备的导管-电极装置(1.1 – 1.5)植入右侧腹侧海马,定位坐标如下:鼻棒 +5.0 mm,前囟前 -3.4 mm,右侧 +4.5 mm,前囟后 +6.5 mm。采用标准的立体定位手术技术进行操作。
    2. 确保不要覆盖固定螺钉。将装置安装到立体定位仪时,应握住导管套件头部,以便与探针架轻松对齐。
  3. 使用至少四枚不锈钢螺钉将装置固定在颅骨上(一枚拧入左侧、一枚拧入右侧额骨板,一枚拧入左侧顶骨、一枚拧入顶间骨板)。在每枚螺钉处滴加一滴组织胶,以进一步将螺钉固定于颅骨。
    1. 用甲基丙烯酸酯骨水泥覆盖螺钉螺纹的一半。通过在骨头上制作浅槽以增加附着力,促进骨水泥的结合。
  4. 将装置的尖端插入脑组织后,将接地电极的导线缠绕在3个固定螺钉上。用牙科水泥覆盖所有已安装的螺钉和装置。
  5. 在手术期间及术后约1小时内监测动物,直至其能够直立并在笼内活动。将动物置于加热垫上,以防止低体温。设备植入后,让大鼠至少恢复7天。
  6. 术后至少每天观察动物一次,持续3天,以监测疼痛或不适症状。在切口部位附近给予抗生素软膏(庆大霉素 0.1%)以预防感染,并给予镇痛剂(腹腔注射曲马多 5 mg/kg)连续3天,以预防术后疼痛。

3. 匹罗卡品诱导颞叶癫痫及实验动物分组

  1. 术后恢复一周后,将动物随机分组:(i) 接受溶剂的对照组动物,以及 (ii) 接受匹罗卡品的癫痫动物。由于并非所有给予匹罗卡品的大鼠都会发病,因此癫痫组的动物数量应按比例增加。
  2. 注射甲基东莨菪碱(1 mg/kg,皮下注射 [s.c.]),30 分钟后,单次注射匹罗卡品(350 mg/kg,腹腔注射 [i.p.])以诱导癫痫持续状态(SE)。对照组大鼠注射甲基东莨菪碱和溶剂(生理盐水)。所有腹腔注射均使用 1 mL 注射器配 25G 针头。
    1. 通过肉眼观察动物是否开始出现行为性癫痫发作(5 分钟内胡须抖动、点头、肢体抽搐),并在 25 分钟内发展为全身持续性抽搐(SE)。
  3. 在癫痫持续状态(SE)发作 2 小时后,通过注射地西泮(20 mg/kg,腹腔注射 [i.p.])终止发作,以实现约 25% 的死亡率,并使平均潜伏期约为 10 天。从匹罗卡品注射后立即开始观察并记录任何癫痫行为,持续至少 6 小时。
  4. 在 SE 后 2–3 天内,使用 1 mL 注射器配 25G 针头给予动物生理盐水(1 mL,腹腔注射 [i.p.]),并使用 1 mL 注射器配 17G 柔性喂食针给予蔗糖溶液(1 mL,口服 [p.o.]),以促进体重恢复。
    1. 将匹罗卡品诱导的 SE 后第一周内未能恢复至初始体重的动物排除出研究(急性组除外,该组在 SE 后 24 小时处死,无法进行体重追踪)。
  5. 将 SE 后的动物随机分配至不同的实验组(图 3):急性期(微透析在 SE 后 24 小时进行)、潜伏期(SE 后 7–9 天)、首次自发性癫痫发作期(约 SE 后 11 天)和慢性期(始于 SE 后约 22–24 天,即首次发作后约 10 天)。监测动物是否出现自发性癫痫发作。
    注意:对癫痫大鼠后续实验采用以下纳入/排除标准:在给予匹罗卡品后 1 小时内出现惊厥性癫痫持续状态;SE 后第一周体重增加;微透析探针和电极位置正确。

4. 癫痫行为监测与分析

  1. 癫痫行为的长期监测
    1. 在给予匹罗卡品约6小时后(即研究人员直接观察结束后),将动物放入清洁的饲养笼中,并开始24小时视频监测。
    2. 使用数字视频监控系统,持续进行24小时视频监测,直至第5天。
    3. 从第5天开始,将动物在其矩形饲养笼中连接至有缆EEG记录系统,并继续24小时视频监测。
    4. 在法拉第屏蔽室外的放大器上设置参数(根据每只动物EEG信号的特性,分别设置各通道的放大倍数),并通过观察未连接导线时产生的EEG信号开始采集。采样频率设为200 Hz,高通滤波器设为0.5 Hz。
    5. 将动物连接至导线:用一只手的两个伸直手指固定动物头部,另一只空闲的手将连接器旋紧到电极基座上,然后开始信号采集。
      注意:确保信号无伪迹。常见伪迹为远超量程的尖峰信号。
    6. 在进行微透析实验的前一天,将动物转移至配备有机玻璃圆筒的有缆EEG系统中。在饲养笼中,通过将连接器从电极上旋下,使动物脱离EEG连接装置,且不束缚动物,随后将动物放入较高的有机玻璃圆筒中。

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结果

探针-电极组装的逐步示意图;图中显示了千分尺测量和树脂应用。
图1. 植入装置的逐步制备过程。(A)三通道电极,左侧为其保护套管内的10 cm长接地电极,右侧为用于微透析的引导套管,用于组装该装置。(B)裸露电极与引导套管的细节图。第一步是将金属引导套管从其塑料假体中反复取出(C)和插入(D)数次,以便在植入动物头部后能顺利分离。(E,F)第二步是将扭绞的记录电极弯曲两次,使其与透析引导套管对齐。(G)电极尖端应被剪裁至比金属引导套管尖端长0.5 mm。(H)使用数字卡尺检查剪裁精度。随后,应使用约1 mm长的硅胶环固定电极与引导套管基部的对齐位置(I)。(J)照片显示如何将电极和引导套管轴部套上硅胶环。(K)最后一步是在引导套管基座上滴加一滴树脂或胶水,将硅胶环固定于其上。(L)组装完成的装置, ready ...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三通道双绞电极Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPC材料
导引套管Agn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.IC材料
树脂 KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2材料
Super Attack 胶水 LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941材料
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)溶液
赛拉嗪(Xylazine)Sigma, Milano, ItalyX1251材料
异氟烷-Vet(Isoflurane-Vet)Merial, Toulouse, France103120022 (AIC)溶液
Altadol 50 mg/ml - 曲马多(tramadol)Formevet, Milano, Italy103703017 (AIC)溶液
Gentalyn 0.1% 乳膏 - 庆大霉素(gentamycine)MSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)材料
快速型简单牙科水泥(simplex rapid dental cement)Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811材料
玻璃离子 CX-Plus 水泥(GlasIonomer CX-Plus Cement)Shofu, Kyoto, JapanPN1167材料
探针夹持器(probe clip holder)Agn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001设备
Histoacryl® Blue 皮肤表面粘合剂TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FP材料
安定 10 mg/2 ml - 地西泮(diazepam)Roche, Monza, Italy019995063 (AIC)材料
带 25G 针头的 1 mL 注射器Vetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05材料
大鼠用柔性饲喂针头 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206材料
Grass Technology 仪器Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08设备(AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40)
模块化数据采集与分析系统 MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSW设备
数字视频监控系统AverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FD设备

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