癫痫诱发大鼠癫痫发作的脑电图记录

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 微透析探针电极装置的组装

1. 使用 3 通道双绞电极（注册电极的切割长度至少为 20 毫米，接地电极长度为 10 厘米），并将其连接到导向套管以准备设备。参见图 1A-1B 中用于透析的 3 通道电极和导向套管的示例。
2. 使用前将金属导向套管取出（图 1C）并插入（图 1D）虚拟塑料套管几次，以便在将其切换到动物微透析探针时轻松将其移除。
3. 将注册电极的双绞线弯曲两次（图 1E-1F），以便将电线与导向器的虚拟套管对齐，并将电极尖端（图 1G）切割成比导向套管尖端长 0.5 毫米（图 1H）使用数字卡尺。
4. 准备好 1 mm 长的硅圆环（外径 [OD] 2 mm，厚度 0.3 mm;图 1I）并使用镊子将导向套管的尖端和扭曲电极的尖端插入硅环中（图 1J）。用快速作用的聚合物胶或树脂将其固定在导管底座的脚上（图 1K）。参见图 1L 和图 2A 中已完成器件的示例。
5. 在杀菌紫外线 （UV） 下对设备消毒 4 小时。将设备翻转四次，使其两侧都暴露在光线下 1 小时
   注意: 许多自制电极和微透析探针可能以类似的方式组装。上述大鼠植入物的头部具有以下尺寸:7 mm 宽 x 5 mm 深 x 从顶部到基座脚趾 10 mm 长;植入尖端长约 11 毫米，直径 600 微米，所有装置重量约为 330-360 毫克。如果 （i） 在手术期间在颅骨上留下足够长的接地电极以供下次使用，并且 （ii） 当动物被杀死时，该设备与牙科粘接剂一起回收，将其留在丙酮中过夜，以便粘接剂可以机械分解， 然后再次清洗和消毒设备。

2. 立体定位手术

1. 按照无菌和无痛手术的现代标准，使用立体定位装置和探针夹支架（图 2B）进行设备植入。
   1. 用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（43 mg/kg 和 7 mg/kg，腹膜内 [ip]）麻醉成年 Sprague-Dawley 大鼠，并将其固定在立体定位框架上。在初始氯胺酮/甲苯噻嗪注射中加入异氟醚麻醉（空气中 1.4%;1.2 mL/min），因为它可以及时控制麻醉深度。剃掉动物头上的皮毛。
2. 用碘基溶液擦拭头部皮肤表面，然后加入 70% 乙醇，为无菌手术做好准备。
   1. 使用以下坐标将优先 （1.1 – 1.5） 准备的导针电极装置植入右腹侧海马体:鼻杆 + 5.0 毫米、A – 3.4 毫米、L + 4.5 毫米、P + 6.5 毫米到前囟。遵循立体定位手术的标准技术。
   2. 确保它没有盖住锚固螺钉。将其安装到立体定位仪上时，抓住导向套管头的装置，因为这可以很容易地与探头支架对齐。
3. 用至少 4 颗不锈钢螺钉将装置固定在颅骨上，将其拧入颅骨（1 颗螺钉进入左侧，1 颗螺钉进入右额骨板，1 颗螺钉进入左顶骨，1 颗螺钉进入顶骨板）。加入一滴组织胶，进一步将每个螺钉固定在颅骨上。
   1. 用甲基丙烯酸水泥覆盖一半的螺纹。通过在骨骼上制作浅槽来促进骨水泥的结合，以增加粘附性。
4. 将设备的尖端定位到脑组织中后，将接地电极的导线绕 3 个锚固螺钉扭动。用牙科水泥覆盖所有已安装的螺钉和设备。
5. 在手术期间和之后约 1 小时内监测动物，直到它们直立并在笼子周围移动。将它们放在加热垫上以避免体温过低。让大鼠在装置植入后恢复至少 7 天。
6. 手术后 3 天内至少每天监测动物一次，是否有疼痛或痛苦的迹象。在切口部位附近给予带有抗生素乳膏（庆大霉素 0.1%）的动物以防止感染，并给予镇痛药（曲马多 5 mg/kg，ip）3 天以防止术后疼痛。

3. 毛果芸香碱诱导颞叶癫痫并将动物分配到实验组

1. 术后恢复一周后，将动物随机分配到以下组:（i） 接受载体的对照动物和 （ii） 将接受毛果芸香碱的癫痫动物。对于癫痫组，使用成比例的较高数量的动物，因为并非所有给予毛果芸香碱的大鼠都会患上这种疾病。
2. 注射一定剂量的东莨菪碱（1 mg/kg，皮下注射 [sc]），30 分钟后，单次注射毛果芸香碱（350 mg/kg，ip）以诱导癫痫持续状态 （SE）。将甲基东莨菪碱和载体（盐水）注射到对照大鼠中。使用 1 mL 注射器和 25G 针头进行所有 ip。
   1. 目视检查动物是否开始出现行为性癫痫发作（在 5 分钟内移动触震动、点头、克隆四肢）并在 25 分钟内连续克隆整个身体 （SE）。
通过
3. 施用地西泮 （20 mg/kg，ip） 在发作后 2 小时阻滞 SE，死亡率约为 25%，平均潜伏期约为 10 天。观察并记录毛果芸香碱注射后立即开始的任何癫痫发作行为，此后至少持续 6 小时。
4. SE 后 2-3 天，使用 1 mL 注射器和 25G 针头给动物生理盐水（1 mL，ip）和使用 1 mL 注射器和柔韧喂养 17G 针头的蔗糖溶液（1 mL，口服），以促进体重减轻的恢复。
   1. 从研究中排除毛果芸香碱 SE 后第一周内未达到初始体重的动物（SE 后 24 小时死亡的急性组除外，其中体重无法随访）。
5. 将 SE 后动物随机分配到不同的实验组（图 3）:急性期（微透析在 SE 后 24 小时进行）、潜伏期（SE 后 7-9 天）、第一次自发性癫痫发作（SE 后约 11 天）和慢性期（从 SE 后约 22-24 天开始，即第一次癫痫发作后约 10 天）。监测动物是否发生自发性癫痫发作。
   注意: 使用以下纳入/排除标准对癫痫大鼠进行进一步实验:毛果芸香碱给药后 1 小时内发生惊厥性 SE;SE 后第一周体重增加以及微透析探针和电极的正确定位。

4. 癫痫行为监测与分析

1. 长期监测癫痫行为
   1. 毛果芸香碱给药后约 6 小时（即，在研究人员直接观察结束时），将动物放入干净的家笼中并开始 24 小时视频监测。
   2. 使用数字视频监控系统继续 24 小时视频监控直至第 5 天。
   3. 从第 5 天开始，将家中矩形笼中的大鼠连接到系留脑电图记录系统，并继续 24 小时视频监测。
   4. 在位于法拉第笼外的放大器上设置参数（根据每只动物的脑电图信号的特异性在每个通道上设置放大因子），然后开始脑电图采集，观察未连接电缆产生的脑电图信号。使用 200 Hz 的采样率和设置为 0.5 Hz 的低通滤波器。
   5. 将动物连接到电缆上，用一只手伸出的两根手指固定动物的头部，然后用另一只空闲的手将连接器拧到电极基座上。开始采集。
      谨慎:确保信号没有伪影。常见的伪影是大大超出比例的尖峰。
   6. 在微透析实验前一天，将动物转移到配备有机玻璃圆柱体的栓系脑电图系统中进行微透析。断开动物与家笼中的 EEG 栓系系统的连接，在不约束动物的情况下拧上电极的连接器。将动物放入高有机玻璃圆筒中。

图 1.要植入的装置的逐步准备。（A） 3 通道电极，左侧保护套管中带有 10 cm 长的接地电极，右侧是组装设备所需的用于微透析的导向套管。裸露的电极和导向套管的细节。第一步是将金属导向套管从其塑料假人中取出并插入 （D） 几次，以便在植入动物头部后轻松释放。第二步是将扭曲的配准电极弯曲两倍，使其与透析引导套管 （E， F） 对齐。（G） 电极尖端应切割成比金属导向套管尖端长 0.5 毫米。（H） 使用数字卡尺检查切割精度。随后，应使用约 1 mm 长的硅圆环固定电极的对齐方式以引导套管脚 （I）。（J） 显示如何环电极和导向套管轴的照片。最后一步是将一滴树脂或胶水滴在导向套管底座上，将硅圆环固定到它上面 （K）。（L） 组装好的装置，准备进行消毒。

图 2.用于大鼠微透析脑电图的不同类型设备的照片 （A） 和用于植入这些设备的探针夹支架 （B） 的照片。（A） 通常在实验前 24 小时用微透析套管替换引导套管（绿色）。该设备的电气连接器（左一用于本手稿中描述的录音）允许将电信号传导到放大器和数据收集设备的电线。该装置通过手术连接到麻醉大鼠的头骨上，以后可以获得记录，而不会对行为自由的大鼠造成疼痛或不适。

图 3.试验设计。在癫痫持续状态 （SE） 诱导前一周，大鼠植入该装置。SE 由毛果芸香碱诱导，动物 （如果未在 SE 后 24 小时透析并杀死;急性组大鼠）视频监测 5 天（蓝线），然后视频脑电图监测以评估癫痫发作频率和持续时间在它们的家笼中（绿线）。对于微透析实验，在微透析前24小时内将癫痫大鼠和相应的非癫痫对照大鼠转移到另一个配备有圆柱笼的脑电图装置中，并且仍然监测视频脑电图（浅绿线）。垂直红线代表癫痫疾病发展不同时间点的透析过程。水平红线代表癫痫动物的不同组（以及相应的非癫痫动物），其中箭头表示微透析的最后一天和动物死亡的日期。