记录急性海马脑片中的神经元场兴奋性突触后电位

摘要

来源：Weng, W.，等。在小型循环灌流浸没式切片记录海马急性脑片中的突触可塑性。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了在浸没式记录舱中放置脑切片以记录突触活动的操作流程。该过程包括将切片固定在镜片纸上，持续灌注人工脑脊液（aCSF）以维持神经元的活性，以及将刺激电极和记录电极准确地定位在特定的目标脑区附近。该装置可实现对基础突触活动以及电刺激效应的精确监测。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 在浸没式切片记录室中记录突触反应

注意： 参见材料表。

1. 将aCSF溶液在水浴中预热至约28–30 °C（以防止记录室中产生气泡）。
2. 启动循环系统（4-5 mL/min），并打开管路加热器，使系统平衡至少1小时。
3. 将一小片镜头清洁纸和固定在U形铂金丝上的尼龙网在浸没式切片室中预浸泡几分钟图1).
4. 移除U形铂丝。
5. 关闭循环，将切片置于镜头清洁纸上。
6. 立即将承载脑片的网格置于脑片上方，打开泵，使脑片在不将物镜浸入aCSF的情况下平衡30分钟。
7. 填充硼硅酸盐微量移液管（即， 将记录电极（尖端电阻：1-2 MΩ，用 aCSF 填充至三分之一）用 aCSF 灌注，并安装到移液器支架中。
8. 将测试用的环氧树脂绝缘钨刺激电极置于操纵器夹持器中，参考电极导线置于切片室中。
9. 在记录电极的放大器头级参考接口上连接第二个参考电极至记录舱内图1A).
10. 在放大器控制软件中，单击“零钳制模式”复选框，然后双击“输出增益列表”框。选择增益为“100”，双击“高通滤波器列表框（贝塞尔）”，选择“0.1 Hz”，再双击“低通滤波器列表框（交流）”以选择“3 kHz”。
11. 在记录软件中，点击“Acquire | Open Protocol”，选择一个具有以下设置的实验方案：允许进行片段式刺激，并以10-20 kHz的采样频率对放大后的电位信号进行50-100 ms的数字化采集，且在片段记录开始后10 ms自动触发电刺激隔离器。
12. 将刺激电极和记录电极平行于锥体细胞层呈直线放置，例如（图 1B 和 图2).
13. 单击“采集 | 编辑方案”，然后在弹出窗口中选择“触发”选项卡。点击“触发源”框，并选择“空格键”作为触发源。单击“确定”按钮。单击“记录”按钮以开始采集，注意此时出现的带有触发按钮的弹出窗口。
14. 在刺激隔离器软件中，点击“电压控制”框并输入“0”，然后点击“下载”按钮。切换到“记录软件”窗口并按下空格键。重复此循环，依次在“电压控制”框中输入从1到8的数值，例如以1 mV为步长。
15. 将刺激强度与fEPSP斜率值相关联，并确定获得fEPSP斜率最大值40%所需的刺激强度。点击“电压控制框”并输入确定的数值，然后点击“下载”按钮。
    注意： 使用刺激隔离器向脑组织施加短暂的电压或电流脉冲。双相脉冲每相持续时间为100 µs。
16. 在记录软件中，点击停止按钮，然后点击“Acquire”菜单。在弹出窗口中点击“Edit Protocol”，选择“trigger”选项卡。点击触发源设置框，选择“internal timer”作为触发源。点击“OK”按钮。点击记录按钮，开始每隔30秒自动记录场电位，例如。30至60分钟后，点击“stop”按钮。
17. 单击“Acquire”菜单，选择“Open Protocol”，选取所需的突触可塑性诱导方案，然后单击“OK”按钮。单击“record”按钮以自动启动高频刺激与记录。单击“stop”按钮。
    注意： 若研究涉及突触可塑性，在长时间记录基础状态后，采用标准的长时程增强或长时程抑制诱导范式。代表性突触传递调制结果如图所示。 图 4 和 图5.
18. 在记录软件中，点击“Acquire | Open Protocol”，选择与步骤 4.12 相同的协议。点击“OK”按钮，然后点击“record”。持续自动运行场电位记录约 2–4 小时。点击“stop”按钮以终止记录。
19. 对于药理学研究，若需持续给予化合物，可将该化合物直接加入 aCSF 储液槽中图3).

结果

图1：浸没式脑片记录室中出流碳合气供氧系统的组成部分。（A）浸没式脑片记录室示意图。图中显示了用尼龙纤维固定在U形铂丝上的海马脑片。银丝缠绕在小导管上形成线圈，以增大银丝末端的表面积。刺激参考电极置于出流室中，记录参考电极则位于主记录室中。为在不同液面高度下保持参考电极电位稳定，记录参考电极的银丝可用塑料管绝缘，仅使电极的“水下”部分暴露于灌流液中。（B）明场图像显示一个典型的急性海马脑片及电极位置。CA1、CA3：阿蒙角1区、3区；DG：齿状回；sub：下托；EC：内嗅皮层。（C）示意图突出显示了出流碳合气供氧系统的主要组件，未标示碳合气流量计和蠕动泵...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电生理学设备与材料
垂直拉针仪	Narishige, Japan	PC-10
隔振台	Meirits, Japan	ADZ-A0806
浸没式记录浴槽	Warner Instruments	RC-26GLP
恒温水浴锅	Zhongcheng Yiqi, China	HH-1
四轴显微操作器	Sutter, USA	MP-285, MP-225
铂丝	World Precision Instruments	PTP406
放大器	Molecular Devices, USA	Multiclamp 700B
数据采集系统	Molecular Devices, USA	Digidata 1440A
分析软件	Molecular Devices, USA	Clampex 10.2
荧光显微镜	Nikon, Japan	FN1
LED 光源	Lumen Dynamics Group, Canada	X-cite 120LED
微量移液管	Harvard apparatus	GC150TF	细胞外记录
硼硅酸盐微量移液管	Sutter, USA	BF150-86	膜片钳
钨电极	A-M Systems, USA	575500
蠕动泵	Longer, China	BT00-300T
蠕动泵管（进液）	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0309	1根进液管，内径：1.02 mm
蠕动泵管（出液）	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0319	2根出液管，内径：2.79 mm
CCD 相机	PCO, Germany	pco.edge sCMOS
镜头清洁纸	Kodak
50 ml 锥形离心管	Thermo scientific	339652
预灌流室	Warner Instruments	BSC-PC
串联加热器	Warner Instruments	SF-28
温度控制器	Warner Instruments	TC-324B
所需试剂
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019318
KCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10016318
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	10017618
MgCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent, China	10012818
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent, China	10005861
NaHCO3	Sinopharm Chemical Reagent, China	10018960
葡萄糖	Sinopharm Chemical Reagent, China	10010518
NaH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20040718
HEPES	Sigma	H3375
丙酮酸钠	Sigma	A4043
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20025118
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019718