新生啮齿类动物脑干-脊髓标本的电生理记录

摘要

来源：Rousseau, J.，等。对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录，以获取神经呼吸网络输出信号。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行的电生理记录。将标本置于记录槽中，在含氧和缺氧条件下，通过脊髓的第四腹根记录来自脑干的吸气爆发活动。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 设置与准备

1. 溶液
   1. 根据以下配方制备人工脑脊液（aCSF）储备液。文献中亦有其他不同浓度配方可供参考。储备液于4 °C保存，可使用一个月。
      1. 盐溶液：加入 75.39 g NaCl（终浓度 129 mM）；2.5 g KCl（终浓度 3.35 mM）；0.81 g NaH₂PO4（终浓度0.58 mM）；2.33 g MgCl₂ （终浓度 1.15 mM）；1.85 g CaCl₂ （1.26 mM）。先溶于800 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。
      2. 碳酸氢盐溶液：加入17.65 g NaHCO₃₃ （终浓度21 mM）。先溶于900 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。碳酸氢盐浓度的改变会导致pH值的变化。
      3. 葡萄糖溶液：加入54.06 g葡萄糖（终浓度30 mM），溶于400 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至500 ml。
   2. 通过将100 ml盐溶液、100 ml碳酸氢盐溶液和50 ml葡萄糖溶液加入1 L蒸馏水中进行稀释，配制aCSF。4 °C保存备用。
   3. 通过加热并拉伸玻璃管直至断裂来制备玻璃电极。使用前将尖端打磨光滑。只要保持清洁，该电极可多次重复使用。
2. 实验装置
   注意： 装置设置的详细信息如下所示 图1.
   1. 打开放大器、移动平均器、数据采集系统、温度控制器和泵。检查信号放大倍数（增益 = 10,000）、滤波设置（低频阈值 10 Hz；高频阈值 5 kHz）以及原始信号模数转换的采样率（2.5 kHz）。
   2. 用aCSF填充瓶子，并用碳合气（95% O₂，5% CO₂）通气₂，5% CO₂₂在记录室（体积5 ml）中以4 ml/min的速度灌注含气泡并预热的aCSF。记录室温度保持在26（±1）°C。在这些标准条件下，pH值应为7.4。
   3. 在解剖室附近准备一个50 ml注射器，内含50 ml室温（RT）且通入碳合气（carbogen）的aCSF。
   4. 打开计算机并启动记录软件。

2. 解剖

1. 称重并目视确定动物性别（雄性肛门与生殖器之间的距离较长，而雌性该距离较短；雄性生殖器通常呈深色，雌性则为粉红色）。
2. 通过以下任一方法对新生啮齿类动物进行麻醉：低温麻醉（将动物完全浸入冰中 4–5 分钟）、注射麻醉（按 4 ml/kg 剂量注射 equitensine）或吸入挥发性麻醉剂（异氟烷或乙醚）。通过观察肢体回缩反射是否消失来确认麻醉深度是否足够。
3. 将动物腹面朝下放置于实验台面上。使用手术刀在前囟（bregma）水平位置（可通过皮肤和颅骨观察到）对头部进行冠状面切割。此步骤应在动物麻醉后立即进行。
4. 使用手术刀在前肢下方对躯体进行冠状面切割。
5. 使用手术剪和细剪以及镊子去除皮肤、肌肉、脂肪组织和内脏。由于此阶段骨骼较软，操作时需小心避免损伤神经系统。该步骤在实验台面上进行。
6. 将制备好的标本置于解剖室中。使用注射器中储存的 aCSF 对标本进行供氧。从此时起直至记录结束，均需使用显微镜进行操作。
7. 在标本背侧，使用手术剪和细剪及镊子沿中轴线从头端至尾端剪开颅骨和椎骨。打开切开的颅骨和椎骨以暴露神经组织。使用注射器中储存的 aCSF 对标本进行供氧。
8. 用镊子去除覆盖在神经组织表面的蛛网膜（一层薄膜组织），保留紧贴神经组织的软脑膜和血管。使用注射器中储存的 aCSF 对标本进行供氧。
9. 将标本背面向下放置，固定标本位置，用剪刀小心剪断神经和结缔组织，使脑干和脊髓缓慢下移。也可采用背侧入路方式。尽可能保留神经根和神经的长度。去除骨骼以分离出脑干和脊髓。使用注射器中储存的 aCSF 对标本进行供氧。
10. 使用手术刀切断小脑及其余头端结构并予以去除。使用针头中储存的 aCSF 对标本进行供氧。
11. 根据实验设计需要，可选择使用手术刀在小脑下动脉前方进行冠状切面切除脑桥。需注意，保留完整脑桥会使大鼠的节律变慢，并完全抑制小鼠的节律。仅包含脑桥尾侧部分的标本可在 C4 神经根处表现出频率稳定的呼吸样活动。

3. 记录

1. 将制备样本置于记录室中，腹侧朝上。用固定针将样本固定在脊髓最下部和脑干最前部。
2. 使用通过针头与电极相连的注射器，通过抽拉注射器活塞在电极内产生负压（玻璃尖端直径：150 - 225 µm），以部分充入人工脑脊液（aCSF）。
3. 利用显微操作器，小心地将电极靠近第四腹根之一。其他腹根也可能呈现类似呼吸的活动（例如，XII 颅神经、C1 腹根）。
4. 通过注射器抽拉活塞，在电极储液罐内产生负压，轻柔地吸住神经根丝。然后小心移动电极，使其紧贴脊髓。
   注意：理想情况下，根丝的大小应与电极开口相匹配，从而在电极内外腔之间形成密封。由于此类记录通常使用差分放大器，电极内部与记录室之间的任何开放都会降低信号质量，并使背景噪声难以消除。
5. 开始记录。
6. 在常氧条件下（即，用含碳合气（carbogen）饱和的 aCSF：95% O₂ 和 5% CO₂）记录样本产生的节律至少 20 分钟，以确定样本的基础参数。
7. 将灌流液从含碳合气饱和的 aCSF 切换至刺激用 aCSF（即，用 95% N₂ 和 5% CO₂ 饱和以诱导缺氧刺激）持续 15 分钟。根据实验方案调整暴露时长。在记录和动物数据表中记录暴露持续时间。尽可能使用不锈钢管连接 aCSF 瓶与记录室，以避免气体向管外扩散。
8. 将灌流液恢复至标准的含碳合气饱和 aCSF 至少 15 分钟，进行恢复期记录。在记录和动物数据表中记录此过程。
9. 结束记录。

结果

图 1. 实验装置的概要示意图。 饱和氧气的 aCSF 经加热后由泵输送至记录室。记录室中多余的 aCSF 通过泵抽出并废弃。记录室连接至接地端和温度控制器。电极信号直接传送到放大器，随后传送至移动平均器和数据采集系统，最终传输至计算机。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	在通风橱内使用
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-葡萄糖	Bioshop	GLU501
碳合气	Linde	343-02-0006
温度控制器	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
吸引电极	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 573000
差分交流放大器	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 1700
移动平均器	CWE, Ardmore, PA, USA	型号 MA-821
数据采集系统	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	型号 DI-720
LabChart 软件	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism 软件	Graphpad, La Jolla, CA, USA
记录室	自制
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA
显微操作器	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	MB
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA	KITE-R
蠕动泵	Gilson, Middleton, WI, USA	MB
法拉第屏蔽笼	自制	MINIPULS 3
计算机