幼年啮齿类动物的长期连续脑电图监测

摘要

来源：Zayachkivsky, A. 等. 使用Epoch无线发射系统在人类疾病的小型啮齿动物模型中进行长期连续脑电图监测. J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了利用无线发射系统对幼年啮齿类动物进行长期连续脑电图（EEG）监测的技术。发射器包含两个记录电极和一个参考电极，可延伸至大脑表面。将幼鼠放入记录舱后，可对其从发育期至成年期的脑电活动进行持续监测。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术准备

1. 清洁并准备发射器，以确保手术安全且无菌。将发射器从防静电包装中取出，喷洒或浸泡于70%乙醇中。用无菌生理盐水冲洗发射器，并将其置于浸有无菌生理盐水的无菌棉垫之间，或保持其浸没在无菌生理盐水中。
2. 收集并灭菌手术所需器械，采用蒸汽高压灭菌法进行灭菌。手术器械列表详见材料与试剂表。

2. 外科植入手术

1. 根据IACUC批准的方案对动物进行麻醉并维持麻醉状态。在手术开始时及手术过程中，每15分钟检查一次足趾夹捏反射。无反应表明麻醉深度足够。
   1. 对于幼鼠，使用4%异氟烷（isoflurane）与O₂混合进行麻醉₂ （100%）。对于成年动物，使用氯胺酮（100 mg/kg）联合赛拉嗪（10 mg/kg）。
2. 固定立体定位仪位置。将耳棒尖端插入外耳道。注意不要过度拧紧耳棒，因为幼年大鼠幼崽的颅骨非常柔软。固定麻醉鼻罩。
   1. 手术过程中，将动物置于设定为37°C的加热垫上以保持体温。对于成年动物，需在眼睛上涂抹润滑眼膏。
3. 消毒切口部位并保持无菌手术区域。
   1. 用70%乙醇和碘伏交替擦拭头皮，从头皮中央开始，逐渐向外做越来越大的同心圆。
   2. 用手术巾覆盖动物，并在覆盖后的动物上进行手术。通过使用无菌手术巾铺设手术区域，并用70%乙醇喷洒设备，以维持无菌手术环境。
   3. 穿戴无菌外科手套和手术衣（或根据机构要求穿戴）。为协助维持无菌区域，应使用手术助手。
4. 在动物头部两眼稍后处沿中线做一长约2厘米的切口。使用手术刀时需格外小心，因幼鼠颅骨仍较柔软。应做单一切口，以减少出血并促进更快愈合。
5. 暴露颅骨。准备一个清洁干燥的区域，以最大限度地增强发射器与颅骨之间的结合力。使用动脉瘤夹夹住头皮。
   1. 轻轻从四个角将头皮从中线处剥离。观察颅骨上的解剖标志，如前囟（bregma）和后囟（lambda）。请注意，此年龄段动物的颅骨骨缝尚未融合。使用Paxinos立体定位坐标图谱确定钻孔的准确位置。
6. 使用Dremel型工具配合球形钻头，在期望的记录位置钻出两个直径大于300 µm的孔。将参考电极的钻孔位置置于颅骨λ点后方的小脑区域上方。
7. 确保发射器上的导线与颅骨钻孔对齐。如果电极导线未对准，电极可能被胶污染，从而导致信号质量下降。为对齐导线，应检查发射器的安装位置，并轻轻弯曲电极，使其与预定的颅骨钻孔位置对齐。
8. 修剪电极导线。使用手术剪将电极修剪至所需长度。电极插入深度对于实验所需的记录类型至关重要（即将电极置于硬脑膜上方以记录脑电图，或使用立体定位坐标针对特定脑结构进行操作。
9. 在发射器底部均匀涂抹氰基丙烯酸酯，确保覆盖整个区域，但避免涂到电极上。氰基丙烯酸酯胶水为电绝缘体，若电极被胶水污染，将导致无信号输出。
   1. 若记录深部脑区结构，将发射器安装至套管固定器上，并将其置于立体定位仪的Z轴控制臂中。通过立体定位仪将发射器下降至适当深度，并在发射器周围涂抹氰基丙烯酸酯凝胶。
10. 在放置发射器前彻底干燥颅骨，以确保粘合剂形成牢固的粘结。将涂有氰基丙烯酸酯的发射器贴附到颅骨上，注意使电极与相应的颅骨钻孔对齐。
    1. 尽量避免损伤主要血管结构。将发射器轻轻按压固定在原位，持续一分钟。施加轻微压力，使发射器与颅骨之间形成牢固的结合。
11. 在发射器与颅骨界面处涂抹额外的氰基丙烯酸酯胶水，确保完全密封。为保证良好的贴合度和牢固的粘接，应尽量增大胶水与颅骨接触的表面积。围绕发射器周围环形涂抹氰基丙烯酸酯胶水，确保颅骨和发射器壁均被覆盖。
12. 通过注射器将化学促凝剂（0.1 ml）滴加在植入式发射器基部周围的氰基丙烯酸酯周围。促凝剂应少量使用，注意避免接触邻近组织。
    注意： 氰基丙烯酸酯固化促进剂可加快化学固化过程，确保发射器与颅骨之间快速形成牢固结合。使用氰基丙烯酸酯加速剂有助于加快粘合剂的固化速度，但并非必需。
13. 用无菌生理盐水彻底冲洗该区域以去除促凝剂。若未将氰基丙烯酸盐促凝剂从切口区域冲洗干净，可能会引起组织刺激。冲洗时，用1.0 ml注射器抽取无菌生理盐水，通过注射器针头对该区域进行灌洗。通常，0.5 ml生理盐水足以清除促凝剂。
14. 在发射器基部周围缝合皮肤，但不要覆盖发射器。发射器顶部必须暴露于皮肤表面，以有效传输神经信号。皮肤应紧贴发射器及周围胶水区域。使用Vicryl或丝线（软质缝线）；幼龄动物皮肤较软，若未使用软质缝线易造成损伤。成年动物可使用任意缝合材料。
15. 将动物从立体定位仪中取出，置于加热垫上恢复。
16. 确保动物保持温暖（37 °C）且可自主活动（即，完全恢复）后再放回母鼠笼中。通过捏住动物背部皮肤来检查其是否脱水（若动物脱水，皮肤会保持变形状态）。如果动物脱水，应皮下注射乳酸林格液。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得将其无人看管。
    1. 为动物注射布托啡诺（0.05 mg/kg）以进行术后镇痛，并在注射部位周围皮下注射0.1 ml布比卡因。
       注意： 从开始到结束，该年龄段动物（出生后第6天）的整个操作应在5-10分钟内完成。对于年龄较大的动物，手术时间可能更长。

3. 护理与饲养

注意：某些母鼠可能无法耐受植入设备的幼鼠。应选择具有耐受性的母鼠。母鼠通过抓住发射器来移动幼鼠在笼内的位置是可接受的。

1. 动物断奶后，应单独饲养，以避免被同笼动物移除设备。
2. 当动物出现痛苦迹象时，使用戊巴比妥钠致死剂量（25 mg/kg）或异氟烷（置于钟形罩内）实施安乐死。
3. 注意：某些带有金属丝插件的动物饲养笼可能会干扰植入式发射器。务必检查金属丝插件的高度，确保动物不会将发射器卡在插件的“栏杆”之间。

4. 记录脑电图

1. 将动物单独饲养在笼中，或与同窝幼崽及母鼠共同饲养。但每个笼子中只能放置一只植入设备的动物。幼崽在记录舱内单独停留时间不得超过2小时。密切监测动物是否出现痛苦或脱水迹象。
2. 将配套的电源连接至接收器底座，并确认电源指示灯亮起。使用卡口式尼尔-康塞曼（BNC）电缆将接收器底座连接至数据采集系统。
3. 将动物笼置于接收器底座上方（图1）。"信号"指示灯应亮起，表示已检测到发射器。此时可开始记录数据。
4. 为记录数据，需将接收器底座连接至模数转换器，并将转换器连接至计算机（图2）。
5. 设置记录的采样率。确保数据被正确采样。记录时采样率应至少设置为250 Hz（推荐500 Hz）（发射器带宽为0.1-100 Hz）。
6. 保存数字化数据，并使用Matlab等信号处理软件包进行分析。

结果

图1：发射器与接收器。 该款无线发射器（A）重4 g，体积<1.4 cm³，尺寸为7 mm × 12 mm，可轻松安装于大鼠和小鼠的颅骨上。该发射器可放大两通道生物电位信号，持续工作长达6个月，之后电池耗尽；使用更大容量的电池可延长记录时间。将动物置于标准啮齿类动物笼具中，并放置在Epoch接收器（B）上方。右侧展示的是早期两个独立记录装置的示例，每个装置可同时记录16只动物的信号，表明每个记录装置所占空间相对较小（2英尺 × 4英尺，约60 cm × 120 cm）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌外科手套	Protective Industrial Products	100-3201 PF	无粉无菌乳胶外科手套
手术刀柄	FST	10003-12
15号手术刀片	FST	10015-00
精细剪刀	FST	14090-09
磨钻工具	Ram Products, Inc.	Microtorque II
精细磨头	FST	19007-07
动脉瘤夹	ROBOZ	RS-5422
有齿镊	FST	11022-14
棉签	McKesson	24-103
持针器	WPI	521725	Olsen-Hegar 持针钳
氰基丙烯酸酯凝胶	Henkel	Loctite 4541
氰基丙烯酸酯促进剂	Henkel	Loctite 7452
缝合线	Ethicon	Vicryl RB-1 J304
电凝器一次性头端	Bovie	AA01	细头
手术托盘	FST	20311-21
Epitel 接收基座	Epitel Inc	N/A
Epitel 无线发射器	Epitel Inc	N/A
Biopac 数字化仪	Biopac	MP-150
PC 兼容计算机