利用强直性刺激在海马脑切片中诱导局部CA1区γ振荡

摘要

来源：Hatch, R. J., 等. 通过强直刺激产生局部 Ca1 γ 振荡。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了在小鼠海马脑片的CA1区通过强直刺激诱导局部γ振荡的过程。该方法对于理解神经元网络活动具有重要意义。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脑切片制备的设置

1. 配制切割液，其成分为（mM）：125 Choline-Cl、2.5 KCl、0.4 CaCl₂、6 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、20 D-葡萄糖，用碳合气（95% O₂–5% CO₂）饱和；另配制人工脑脊液（aCSF）记录液，其成分为（mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl₂、2 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、10 D-葡萄糖，用碳合气饱和。将切割液置于冰上保持低温。
2. 将约400 ml切割液冷冻后与100 ml未冷冻的切割液混合，制成冰浆。通过细径管或烧结玻璃通入碳合气（95% O₂–5% CO₂），气体流速约为0.5 L/min，产生持续而温和的气泡流。
3. 准备一个250 ml烧杯，内置抬高的尼龙网片，用于放置脑切片。加入aCSF至液面高出网片约2 cm，并通入碳合气，确保气泡不会直接冲击切片放置区域。需注意尼龙网中不得残留气泡，如有则应清除。此装置作为切片保存室，保持在室温（20–25 °C）。
4. 摆放解剖器械，包括大剪刀、小剪刀、大小不同的微型刮勺，以及大小镊子，并将其置于冰上预冷。将振动切片机的组织切割块放在铝箔包裹的冰上。另准备两片6 cm滤纸、一片单刃剃须刀片，以及一个盛有切割液冰浆的25 ml烧杯。
5. 另取一个容器装满冰，在冰上铺一张滤纸，并将一个12 cm培养皿置于其上。向培养皿中加入切割液冰浆，并通入碳合气。此容器用于进行脑组织解剖操作。
6. 准备振动切片机。从包装中取出新的双刃剃须刀片（每次均需使用新刀片），先用80%乙醇喷洒，再用去离子水冲洗。将一个3 ml塑料移液管在开始变细处剪断，用于转移脑切片。将27 G针头在根部弯曲约45°，并连接至1 ml注射器上，用于在切片过程中操控组织。

2. 切割脑片

1. 使用2%异氟烷或当地批准的方法麻醉一只小鼠（P16-P18）。诱导麻醉后，用一把大剪刀将动物断头，并将头部放入盛有通氧切割液浆的12 cm培养皿中。浆液必须完全浸没头部，以实现快速冷却。
2. 用一只手固定头部前端，将皮肤和结缔组织向前剥离至鼻部。使用小剪刀剪开结缔组织，暴露下方颅骨。随后去除覆盖在颅骨背侧及颈部的肌肉。
3. 首先用大镊子固定颅骨前部，然后用小剪刀在枕骨大孔两侧的骨头上做两个侧向切口，将脑组织从颅骨中取出（图1，切口标记为A1和A2）。
   1. 在两眼之间（略位于前囟前方）做另一切口（图1，切口标记为B），然后沿矢状缝向前小心剪开，掀开颅骨片以暴露脑组织（图1，切口标记为C）。
   2. 使用小刮勺将脑组织挖出并置于培养皿中。注意脑组织腹侧的颅神经需被切断，可使用更小的微型刮勺完成。随后用较大的刮勺将脑组织转移至装满切割液浆的25 ml烧杯中。
4. 准备用于切片的脑半球。
   1. 将一片6 cm滤纸置于新的培养皿底部，加入新鲜的切割液浆并通氧。用较大的刮勺将脑组织腹侧朝下放置在滤纸上。取一把新的、清洁的单刃剃刀，切除小脑，然后沿中线切开，将脑组织分为两个半球。
5. 准备振动切片机的组织块。
   1. 取预冷的振动切片机组织块，擦干表面，在中央滴一滴氰基丙烯酸酯胶水，并均匀涂抹至与脑组织大小相近的范围。用小刮勺将其中一个脑半球转移至大号微型刮勺上，使脑组织内侧面朝下。
   2. 将刮勺边缘接触第二张滤纸上的脑组织界面，尽可能去除多余液体。用小刮勺引导，将脑组织从大刮勺上滑入胶水中。
   3. 将切片块固定于振动切片机腔室中，向腔室内加入切割液浆并通氧，确保脑组织完全浸没。旋转切片块，使脑组织腹侧朝向刀片。
6. 切片脑组织。
   注意： 每台振动切片机均具有独特性，请遵循制造商的操作说明。
   1. 设置切片厚度为450 µm，并确保刀片以约0.3 mm/s的速度移动并通过振动穿过脑组织。从腹侧至皮层表面完全切穿脑组织，可获得可用于电生理记录的完整脑矢状切片。切片顺序由外侧向内侧进行，通常每个半球可获得3–4片切片。
   2. 若切片基部翘起，可用弯曲的27 G针头轻轻将其压回。每切出一片，即用转移移液管将其移至保存室的平台上，切片在此条件下可维持活性长达8小时。

3. 细胞外电生理记录

1. 将脑片安装到记录室中。
   1. 使用转移移液管将一片脑组织放入浸没式记录室，记录室中持续灌流 aCSF，流速为 1 - 2 ml/min，温度维持在 32 °C。用于记录的 aCSF 与储存室中的 aCSF 不同，其 Mg²⁺ 浓度从 2 mM 提高至 4 mM。
   2. 用“琴状固定器”（由半圆形不锈钢框和间距为 2 - 3 mm 的尼龙丝构成）固定脑片。放置琴状固定器时，确保尼龙丝与 CA1 区平行。将灌流速度提高至 8 - 10 ml/min，温度保持在 32 °C。
2. 在解剖显微镜下，将刺激电极和记录电极（充满 aCSF 记录液的玻璃电极）放置于 CA1 区辐射层（stratum radiatum）表面（图 2A）。先放置刺激电极，再放置记录电极。
3. 使用 120 - 150 µA 幅度、0.1 msec 持续时间的测试脉冲刺激 Schaffer 侧支，观察所产生的场兴奋性突触后电位（fEPSP）波形以评估脑片状态（图 2B）。为获得具有较小纤维群峰（fiber volley）和较大振幅的 fEPSP 记录，可能需要将刺激电极和记录电极插入脑片表面下约 50 - 100 µm。Schaffer 侧支诱发的 fEPSP 具有典型特征，是评估脑片健康状况的良好指标。健康的脑片通常表现出纤维群峰与 fEPSP 振幅之比小于 0.3。
4. 重新定位电极。
   1. 在解剖显微镜下，将刺激电极移至辐射层（stratum oriens）中部，并将记录电极尽可能靠近刺激电极地移至锥体细胞层，如 图 3A 所示。可能需要将刺激电极和记录电极插入脑片约 50 - 100 µm，使对 120 - 150 µA 测试脉冲的 fEPSP 反应振幅约为 1 mV。
5. 诱导 γ 振荡。
   1. 为诱导 γ 振荡，以 200 Hz 的频率施加一串包含 20 个、每个持续 0.1 msec 的脉冲进行刺激。该强直性刺激每 5 分钟施加一次时，可产生可重复的反应。
6. 使用以下记录参数。
   1. 调节输出信号增益，使其匹配模数转换器的输入电压范围。确保预期的最大信号偏移至少占用输入电压范围的 30%。设置增益时需谨慎，避免增益过高导致信号截断。场电位记录通常所需的带宽为 500 Hz，采用 0.1 Hz 的交流耦合以消除基线漂移。
   2. 采样频率应至少为低通滤波器截止频率的 4 - 5 倍，以避免信号混叠。

结果

图1. 颅骨及覆盖皮肤的示意图，显示暴露脑组织所需切口的位置。 A1、A2、B 和 C 标示了为打开颅骨以取出脑组织所需进行切口的位置。

图2. 在CA1区Schaffer侧支放置刺激电极和记录电极以检测脑片活性

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-(N-乙基-N-苯基氨基)-1,2-二甲基-6-(甲氨基)嘧啶鎓氯化物（ZD7288）	Sigma-Aldrich	Z3777
荷包牡丹碱（Bicuculline）	Sigma-Aldrich	14340
6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）	Sigma-Aldrich	C127
镍（Nickel）	Sigma-Aldrich	266965
卡马西平（Carbamazepine）	Sigma-Aldrich	C4024
(2R)-氨基-5-磷酸戊酸（APV）	Tocris Bioscience	105
瑞替加滨（Retigabine）	ChemPacific	150812-12-7
氯化胆碱（Choline-Cl）	Sigma-Aldrich	C1879-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-250G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
葡萄糖（Glucose）	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	223506-500G
MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670-500G
电极玻璃管	Harvard Apparatus	GC150F-10
同心双极刺激金属电极	FHC	CBBPF75
数字隔离器	Getting Instruments	Model BJN8-9V1
Model 1800 放大器	A-M systems	Model 1800 amplifier
数据采集器（Digitizer）	National Instruments	NI USB-6211
振动切片机（Vibrotome）	Leica	VT1200s