电生理记录 黑腹果蝇 挥发性气味物质刺激下的感器反应

摘要

来源：Ng, R., 等 电生理记录 果蝇 低挥发性气味物质引起的毛形感器反应。 J. Vis. Exp. (2017).

在本视频中，将一只活体 Drosophila 果蝇固定在管中，用于进行电生理研究。将电极置于嗅觉感受器的基部，以记录果蝇嗅觉受体神经元对信息素产生的特异性神经元反应。

方案

1. at4 记录硬件的准备

1. 使用拉针仪制备电极，采用铝硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.64 mm）。用精细镊子轻微钝化参比电极尖端，以利于插入果蝇的唇基即 位于蝇头部前端口器上方的一个圆形板状结构。
   注意： 使用7日龄的野生型（WT，Berlin）雄性果蝇进行本研究。两种电极均使用AHL生理盐水溶液作为电解质。
2. 配制1 L成虫血淋巴类似液（AHL），将900 mL蒸馏水与6.312 g NaCl、0.373 g KCl、0.337 g NaHCO₃、0.241 g MgCl₂·6H₂O、0.105 g CaCl₂、4.026 g葡萄糖和0.498 g蔗糖混合。₃，0.1120 g NaH₂PO₄，1.892 g 海藻糖 ּ2H₂O、3.423 g 蔗糖、1.192 g HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）和 8.2 mL 1 M MgCl₂。使用蒸馏水将总体积定容至 1 L。用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌。长期保存时，将 AHL 分装样品置于 4 °C.
   注意：棕榈油酸的稳定递送依赖于各 cartridge 之间的一致性。每个 cartridge 必须以可重复的方式进行组装。
3. 使用剃须刀片从200 μL枪头尖端切去0.9 cm µL移液枪头制作第一个卡匣段，长度为4.1 cm；具体尺寸参见图1A。使用另一个200 µ使用L型移液器吸头，从尖端和底部各截去1.7 cm和1.5 cm，制备第二段 cartridge，长度为1.8 cm（图1A）。使用直尺以确保可重复性。
4. 使用一个 ⅛使用打孔器从滤纸上切割圆片。
5. 使用镊子将滤纸圆片放置在第二段层析柱的尖端。目视确认层析柱尖端存在可使空气通过的开口。
6. 连接第一和第二 cartridge 部分，如图 1A 所示。将第二 cartridge 部分向下倾斜，以方便对准预备区域（图 1B）。
7. 将装有气味递送管的 cartridge 连接到显微操作仪上。
   注意该设计可使盒体向外旋转，便于更换（图1C）。
8. 将一个质量控制器中的恒定加湿气流设置为 2 L/min，另一个质量控制器中的气味剂气流设置为 500 mL/min。
9. 使用软件（见材料表），设置程序以释放持续 500 ms 的气味气流。

2. 棕榈油酸气味溶液的制备与递送

注意：Or47b ORN 对 cis- 和 trans-棕榈油酸均有响应。由于棕榈油酸在室温下不稳定，因此储备液需保存在 -20 °C，并在开封后一个月内使用完毕。棕榈油酸的首选溶剂为乙醇。

1. 使用涡旋混合器将10 µL的cis-或trans-棕榈油酸储备液或稀释液与90 µL的100%乙醇在1.7 mL微量离心管中充分混合，进行十倍系列稀释。实验前每天新鲜配制棕榈油酸稀释液，并在当天内使用完毕。
   注意：对于不溶于乙醇的气味物质，建议使用玻璃小瓶，并采用其他类型的有机溶剂配制气味稀释液。
2. 使用P10移液器，将5 µL所需稀释浓度的cis-棕榈油酸溶液滴加至相应 cartridge 中的滤纸上。
   注意：最高剂量（10^-1）含有450 µg化合物。对于trans-棕榈油酸溶液，应改为加入4.5 µL，以确保最高剂量（10^-1）同样含有450 µg化合物。
3. 将含棕榈油酸的cartridge置于真空干燥器中，在室温及7.59 mmHg压力下放置1小时，以彻底蒸发溶剂。
   注意：cartridge在室温下最多可使用4小时。

3. 准备 果蝇 用于便捷接触 at4 感觉刺 在体 内 电生理记录

注意：野生型果蝇（Berlin品系）在标准玉米粉培养基中，于25°C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养。羽化后，果蝇按性别分开，每组十只，群体饲养至7日龄。雄性和雌性果蝇中的Or47b嗅觉受体神经元（Olfactory Receptor Neurons）均对棕榈油酸有反应。为简化实验，本研究仅检测雄性果蝇。

1. 组装果蝇制备载玻片：在玻璃载玻片上，用少量橡皮泥将一块盖玻片（18 × 18 mm²）固定，使其与载玻片形成约3°的倾斜角。在盖玻片内侧边缘及载玻片紧邻下方区域贴上双面胶带。每天记录前均需更换新的胶带（图2A）。
2. 使用果蝇吸取器15将目标果蝇吸入导管中，然后将200 µL移液器吸头套在导管末端。同时向前轻弹导管并吹气，使果蝇移至移液器吸头末端。使用剃须刀片在果蝇身体下方稍低处以及果蝇上方约两个头长的位置进行切割。
3. 用橡皮泥压实移液器吸头底部，推动果蝇向上移动，直至触角和唇基完全暴露（图2B）。为避免杀死果蝇，仅需加入足够暴露触角和触角芒的橡皮泥，以防止果蝇腹部受压。此外，应缓慢且轻柔地添加橡皮泥，避免突然收缩。通过观察触角或喙的运动来确认果蝇是否存活。
4. 使用镊子操控容纳果蝇的移液器吸头，调整果蝇头部方向，使其唇基朝向观察者的右侧。使用精细镊子沿盖玻片调整制备样本，直至触角的侧面紧贴带胶的盖玻片表面（图2B）。
5. 将固定杆置于触角芒上，以将触角固定在双面胶带上，防止其移动（图2B）。
   注意：固定杆由硼硅酸盐玻璃毛细管经拉管仪拉制而成，并用橡皮泥固定位置（图2A）。
6. 将制备好的样本置于显微装置的载物台上（图2C）。通过显微镜确认刚毛型感器可见于触角第三节远端外侧边缘。
   注意：感器应在背景中呈现为轮廓状，便于识别并利于记录（图3）。在此制备方法中，最易接近的刚毛型感器为at4型。
7. 如先前所述2, 15，通过距离样本约2 cm的独立供气管持续向样本提供湿润气流（2 L/min）（图4）。

4. 棕榈油酸刺激下 at4 刚毛型感器中 Or47b 嗅觉受体神经元 at4 感器活性的记录

1. 将参考电极插入唇基（图3A）。动作应迅速而平稳，确保电极刚好插入表面下方，使其能够接触到角质层下的血淋巴，以避免组织损伤。
2. 缓慢降低记录电极，直至其进入目标感器的同一视野平面（图3B）。在50倍物镜下进行记录。
   注意： 由于刚毛状角质层较为坚韧，需将记录电极插入感器基部，该区域较宽，提供了更大的目标面积，可降低电极被偏转的可能性（图3B，插图）。
3. 在对感器施加气味刺激之前，需观察以下筛选标准：任何不符合这些标准的刚毛状感器均应被排除，并选择其他感器替代。
   1. 观察到较高的信噪比（示例见图3C）。
   2. 能够识别出at4A和at4C神经元的明显峰电位（图3C）。
      注意：at4B的峰电位振幅与at4A10非常相似，在无气味刺激的情况下难以区分。
   3. 观察到at4A神经元的基础放电频率约为20 Hz或更低。
      注意：此标准专用于at4A，因为该神经元的基础放电频率高于锥形嗅觉受体神经元。若基础放电频率显著升高，则提示在插入电极过程中神经元可能已受损。
4. 将气味 cartridge 连接到气味递送管。首先使用溶剂对照，然后按浓度由低至高的顺序依次使用气味物质。使用显微操作器将 cartridge 移向样本，并确保 cartridge 正对样本头部。从几毫米远处目视确认 cartridge 直接对准触角（图4）。
   注意：目标是使 cartridge 的开口正对触角，并将其置于目标组织附近。
5. 确保气味 cartridge 与右侧的记录电极相距1–2 mm，与下方果蝇样本载玻片相距约1 mm。
   注意： 在本实验所描述的装置中，气味 cartridge 紧邻记录电极、参考电极以及果蝇样本载玻片（图4）。
   注意：需考虑 cartridge 与记录/参考电极之间的距离，建议距离约为4 mm。意外接触可能导致信号中断，并损坏记录电极尖端，从而损伤当前神经元并影响后续记录。
   注意：需考虑 cartridge 与果蝇样本载玻片之间的距离。若触及盖玻片，也可能导致记录电极移位，干扰记录。
6. 在数据采集软件中点击“Record”以开始记录。
   注意：每次10秒的记录中，会向触角直接递送一次持续500毫秒的气味脉冲，具体操作如步骤1.9所述。
7. 施加气味物质后，在更换为下一较高浓度的 cartridge 前，应小心回撤当前 cartridge。持续操作直至完成整个剂量范围的测试。
   注意：建议每只果蝇仅记录一个Or47b嗅觉受体神经元，以避免可能的适应效应。
8. 每日记录结束后，用蒸馏水彻底冲洗记录电极。
9. 使用 commercially available 离线分析软件对数据进行分析和绘图。

结果

图1：气味释放盒与嗅觉仪装置示意图。（A）气味释放盒的制备。从左至右：标准200 µL移液枪头、第一段和第二段释放盒组件，以及组装完成的气味释放盒。（B）连接至嗅觉仪的气味释放盒，显示第二段组件向下倾斜的结构。（C）嗅觉仪装置示意图，显示安装在显微操作仪上的气味输送管，以及连接的气味释放盒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
准备设置 & 其他材料
拉管仪	Sutter Instruments，美国加利福尼亚州诺瓦托	P97	拉针仪
硼硅酸盐玻璃毛细管	美国佛罗里达州萨拉索塔世界精密仪器公司	1B100F-4	用于固定杆的制作
铝硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国	AF100-64-10	制作电极
Superfrost 显微镜载玻片	美国宾夕法尼亚州匹兹堡费舍尔科学公司	12-550-143	用于果蝇实验准备工作站
永久性双面胶带	苏格兰圣保罗明尼苏达州美国	NA	用于果蝇准备工作站
直立显微镜	奥林巴斯，日本东京新宿	BX51	用于记录装置
Plastalina 油泥	Van Aken，美国南卡罗来纳州北查尔斯顿	B0019QZMQQ	用于准备工作站并固定持握杆
带SFCA膜的快速流动一次性无菌过滤单元，0.45 mm	Nalgene，美国纽约州罗切斯特	#156-4045	灭菌AHL溶液
200 µL移液器吸头	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州，美国	53508-810	制作气味 cartridges 和果蝇准备
滤纸	沃特曼，英国肯特郡梅德斯通	740-E	制作气味 cartridges
真空干燥器	Cole-Parmer，Vernon Hills，IL，美国	VX-06514-30	蒸发乙醇溶剂
顺式棕榈油酸	Cayman Chemical，美国密歇根州安娜堡	#10009871（CAS # 373-49-9）	Or47b 气味受体
反式棕榈油酸	Cayman Chemical，美国密歇根州安娜堡	#9001798（CAS # 10030-73-6）	Or47b 气味受体
乙醇	Spectrum Chemical MFG. 新泽西州新不伦瑞克 美国	E1028-500MLGL	稀释棕榈油酸
气味剂盒微操作器	美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤	MX130R	用于定位嗅觉仪
Flow Vision 软件	Alicat，图森，亚利桑那州，美国	FLOWVISIONSC	控制流速的软件
质量控制器	Alicat，图森，亚利桑那州，美国	MC-2SLPM-D	控制加湿空气的流速
质量控制器	Alicat，图森，亚利桑那州，美国	MC-500SCCM-D	控制气味刺激的流速
Clampex	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	版本 10.4	数据采集软件
空气输送管	Ace Glass，美国新泽西州维尼兰	8802-936	输送加湿空气
50倍物镜	奥林巴斯，日本东京新宿	LMPLFL50X	记录装置
Clampfit 10	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	版本 10.4	用于尖峰分析的软件
Igor Pro 6	WaveMetrics，美国俄勒冈州莱克奥斯韦戈	Ver. 6.37	用于数据分析的软件
音频监视器	ALA科学仪器公司，美国纽约州法明代尔	NPIEXB-AUDIS-08B	听觉报告单个峰电位
细胞外放大器	ALA科学仪器公司，美国纽约州法明代尔	NPIEXT-02F	以增强电信号的幅度
阀门控制器	Warner Instruments	VC-8	控制阀门开启以进行气味刺激
记录电极显微操作器	Sutter Instruments，美国加利福尼亚州诺瓦托	MP-285	放置记录电极
头部放大器	ALA科学仪器公司，美国纽约州法明代尔	EQ-16.0008	增强电信号的幅度
示波器	Tektronix，比弗顿，俄勒冈州，美国	TDS2000C	单个峰电位的可视化报告