小鼠脑楔形切片中听神经根刺激与突触后电流记录

摘要

来源：Fischl, M. J., 等 体外楔形脑片制备以模拟体内神经元回路连接。J. Vis. Exp.(2020)

本视频演示了一种在小鼠脑片切片中刺激听觉神经根并记录内侧耳蜗橄榄核神经元突触后电流的实验方案。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 电生理设置与记录

1. 将楔形脑片放入记录室中，并使用网格固定器或稳定系统固定脑片。以持续灌流方式以7–10 mL/min的流速向组织灌注经碳合气饱和的温热人工脑脊液（ACSF，35 °C）。
2. 使用561 nm发射滤光片的落射荧光显微镜，在斜方体腹侧核（VNTB）中识别基因标记的内侧耳蜗前庭核（MOC）神经元，用于膜片钳记录。若未发现可进行膜片钳记录的细胞，可翻转脑片。
3. 使用微分干涉差（DIC）光学系统，聚焦于脑片较厚一侧的听神经根，并使用显微操作器将双极钨刺激电极移至听神经根处，轻柔插入组织表面。
   注意：其他实验室在听神经刺激实验中曾使用过吸吮电极。若适用于特定实验条件，也可采用Theta玻璃电极或光学刺激方法。
4. 将视野移回VNTB区域，选择一个MOC神经元作为膜片钳电生理记录的目标细胞。
5. 使用适合拟进行实验的适当内液填充记录电极。
6. 对MOC神经元进行全细胞膜片钳记录。根据需要补偿膜电容和串联电阻。
7. 调节听神经根的电刺激强度，以在MOC神经元中获得稳定的突触后反应。
   注意：可能需要调整刺激电极的位置。
8. 运行适当的刺激程序，以观察MOC神经元中诱发的突触电流（电压钳模式）。
   注意：楔形脑片制备方法可与任何常规膜片钳技术联用，例如松散封接记录、药理学干预、光遗传学、钙成像、神经递质解笼等。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A1R 直立共聚焦显微镜	Nikon Instruments		电生理与成像显微镜，可使用任何兼容电生理的显微镜
电极硼硅酸盐玻璃管，带丝，外径 1.5 mm，内径 1.1 mm，长 10 cm	Sutter Instrument	BF150-110-10	膜片钳移液管玻璃
电极填充器 MicroFil	WPI	CMF20G	膜片钳电极移液管填充器
在线溶液加热器	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	脑片灌流系统加热器
多通道微操纵系统	Sutter Instruments	MPC-200 配 MP285	用于膜片钳和刺激电极定位的微操纵器
P-1000 水平玻璃微电极拉制仪	Sutter Instruments	FG-P1000	膜片钳移液管拉制仪
膜片钳放大器及软件	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Next	可使用任意放大器/软件
记录室	Warner Instruments	RC26G	记录期间脑片"浴槽"
记录室压片	Warner Instruments	640253	电生理记录期间稳定脑片
脑片孵育室	定制构建		切片后恢复期间加热并供氧的脑片孵育室
刺激隔离单元	A.M.P.I.	Iso-Flex	电生理用刺激隔离单元
60 mL 注射器	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	电生理灌流液体处理
温度控制器	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	脑片灌流系统温度控制器
管路，外径 1/8，内径 1/16	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	电生理灌流液体处理
钨同心双极微电极	WPI	TM33CCINS	电生理刺激电极