记录大鼠海马脑片中CA3-CA1突触反应

摘要

来源：Shetty, M. S. 等，利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了一种在大鼠海马脑片上记录CA3-CA1突触反应的方法。该方法概述了将刺激电极和记录电极放置于海马脑片上的步骤，并通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）来评估突触反应强度。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. CA3-CA1 突触反应的记录

注意：用于场电位记录的电生理装置设置如图1A所示。如果在正确接地后仍存在无法控制的电干扰，强烈建议使用法拉第屏蔽笼。市面上有多种不同类型的浸没式和界面式记录舱可供选择。然而，更推荐使用界面式记录舱，因为脑片在其中表现出更强健的突触反应。

1. 电极定位​
   1. 开启将要使用的电学设备（刺激器和放大器）。将刺激电极和记录电极安装并固定在显微操作器的有机玻璃支架上。
      注意：我们使用电阻为5 MΩ的单极漆包不锈钢电极，同时用于刺激和记录。
   2. 使用前，将这些电极插入拉制的玻璃毛细管内，并用环氧树脂胶固定，仅暴露电极尖端的一小部分（图1E）。这可增强原本细长电极的机械强度，并有助于将其牢固地固定在电极夹持器中。
   3. 在显微镜引导下，将刺激电极置于CA1区辐射层以刺激Schaffer侧支纤维，同时将记录电极置于CA1区顶树突区域以记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）反应。
      注意：将电极接近脑片上方液面时会产生声音信号（前提是放大器连接了扬声器），有助于快速定位脑片表面。
   4. 在突触标记与捕获实验中，根据实验需求，在记录电极两侧放置两个或三个刺激电极（S1、S2或S3），以刺激两个或多个独立但有重叠的输入通路。刺激电极与记录电极之间的距离应约为200 µm。
   5. 如有需要，可在锥体细胞层（stratum pyramidale）中放置另一个记录电极以记录群体峰电位（图2A）。当两个电极均接触脑片后，通过采集软件给予测试刺激，以确认获得良好的fEPSP信号。
      注意：测试刺激采用双相恒流脉冲（脉冲持续时间0.1 msec/半波）。
   6. 一旦获得稳定的fEPSP信号，使用操作器的微调旋钮小心地将电极下移约200 µm深度。让脑片恢复20分钟。
2. 输入-输出关系​
   1. 通过在不同电流强度范围内测量fEPSP斜率，确定每个输入通路的输入-输出关系（传入刺激强度 vs. fEPSP斜率）。测试范围为20 µA至100 µA。然后将每个通路的刺激强度设定为产生最大fEPSP斜率的40%。在整个实验过程中保持该强度不变。
   2. 15–20分钟后开始记录基线。在此期间密切监测fEPSP斜率，若斜率波动超过设定值的10%，则重新调整刺激强度并重新建立基线。在进入下一步前，至少记录30分钟或1小时的稳定基线。
      注意：对于测试或基线刺激，我们每5分钟施加4次0.2 Hz的双相恒流脉冲（每相0.1 msec），共四次扫描。这四次反应的平均斜率视为一次重复。信号经差分放大器滤波和放大后，通过模数转换器数字化，并使用定制软件实时监测。

结果

图 1. 用于场电位记录的电生理实验装置，包括 (A) 刺激器 (b) 差分放大器 (c) 模数转换器 (d) 示波器 (e) 配备采集软件的计算机 (f) 抗振实验台 (g) 配有>4倍放大功能的显微镜 (h) 脑切片界面式记录室 (i) 用于人工脑脊液（ACSF）和碳酰气（carbogen）供给的灌流系统 (j) 温度控制器 (k) 光源 (l) 带有电极夹持器的操纵器。 (B) 界面式脑切片记录室。 (C) & (D) 界面式记录室中的海马切片。 (E) 密封于玻璃毛细管中的不锈钢电极。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
I. ACSF 组分化学品
1. 氯化钠 (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
2. 氯化钾 (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
3. 七水合硫酸镁 (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
4. 二水合氯化钙 (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3881
5. 磷酸二氢钾 (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
6. 碳酸氢钠 (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
7. 无水 D-葡萄糖 (C6H12O6)	Sigma-Aldrich	G7021
II. 电生理学仪器
1. 显微镜	Olympus, Japan	Model SZ61
2. 温度控制器	Scientific Systems Design Inc. Canada	PTC03
3. 差分交流放大器	AM Systems, USA	Model 1700
4. 隔离式脉冲刺激器	AM Systems, USA	Model 2100
5. 示波器	Rhode & Schwarz	HM0722
6. 数模转换器	Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK	CED-Power 1401-3
7. 脑片孵育室（界面式）	Scientific Systems Design Inc. Canada	BSC01
8. 蠕动泵	Ismatec, Idex Health & Science, Germany	REGLO-Analog
9. 碳氧混合气流量计	Cole-Parmer	03220-44
10. 光纤光源照明器	Dolan-Jenner Industries	Fiber Lite MI-150
11. 微操纵器	Marzhauser Wetzlar, Germany	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. 电极	AM Systems, USA	571000 (不锈钢；0.010，5 MΩ，8 度角)