检测果蝇感觉神经元的生理反应

1. 样品制备

1. 越过 Gal4 驱动线到 UAS-GCaMP5G 黑腹果蝇 （w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40）。让十字架在 25 °C 下生长><。 注意:用 Gal4 或 UAS-GCaMP 转基因的多个拷贝生成果蝇有助于增强荧光信号强度。早期版本的 UAS-GCaMP 转基因 （UAS-GCaMP3） 在 Gr68a-Gal4 驱动基因的控制下表达时显示出非常弱的荧光强度。
   1. 收集并按性别分离新封闭的成蝇，并在 25 °C 下饲养
      注意:GCaMP5G 荧光的基线水平在 14 至 28 天龄的果蝇中是最佳的。通过性别隔离苍蝇排除了可能影响神经反应的社交互动的可能性。
2. 在温和的 CO₂ 流下麻醉苍蝇。
3. 首先将一小滴指甲油放在 0.17 mm 盖玻片的中心，将苍蝇连接到玻璃盖玻片上。轻轻地将苍蝇侧放在透明指甲油滴上，并确保苍蝇覆盖整个滴剂。
4. 在解剖立体显微镜下执行步骤 1.5 和 1.6，放大倍率为 8 倍。
5. 使用湿画笔伸展苍蝇的前腿。通过在第一和第五跗骨节段上放置两条细胶带，将前腿固定到位（图 1A）。这将暴露跗骨段 T2-T4 进行成像（图 1B）。
6. 为了对长鼻上的神经元进行成像，在长鼻的喙上放一条细带以暴露标签（图 1C、D）。
7. 用 PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶）笔在果蝇周围画一个疏水屏障，以防止溶液流过盖玻片表面。安装后 30 分钟内测量。

2. 刺激溶液的制备

在
1. PBST（含 Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水）溶液中稀释亲脂性配体（例如本研究中使用的 CH₅0₃）:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、0.1% Triton X-100 （v/v）;pH 值 7.4。
   1. 使用 PBST 制备 1 mg/ml 配体储备溶液。使用 PBST.
      制备储备溶液的所有后续稀释液 注意:根据目标配体的溶解度，可能需要不同的溶剂来溶解它。表 1 描述了 CH₅0₃ 在各种溶剂中的溶解度。与其他溶剂不同，PBST 不会增加荧光。

3. 刺激味觉神经元和图像采集

1. 使用 10 μl 移液器，将 10 μl PBST 放在跗骨段上><。 注意:此步骤可湿润腿部并防止跗骨节段漂移。
2. 使用具有足够速度和灵敏度的相机的光学系统，以在高时间分辨率下获得良好的荧光信号><。 注意: 在这项研究中，我们使用了转盘式共聚焦显微镜和 sCMOS 相机（参见材料列表）。
3. 选择要成像的特定跗骨段和神经元。获取三个预刺激共聚焦 Z 堆栈。
   1. 理想情况下，使用足够快的采集设置，以实现最大的时间分辨率，同时仍能捕获整个细胞体积。采集设置示例包括:200 毫秒曝光，合并 2 x 2 和 6 x 0.5 μm2 光学切片，每 2 秒捕获一次
      注意:固定的腿已以 30 秒的间隔成功成像长达 10 分钟，GCaMP 信号没有明显的漂白。对于更长的记录时间，请确保支腿非常牢固地固定在盖玻片上。
   2. 优化激光功率，在整个成像过程中实现最高的信噪比，同时将光漂白降至最低。对于此处描述的实验，使用 491 nm 二极管激光器 （100 mW） 以 30% 的透射率对腿部和喙上的 Gr68a 和 ppk23 味觉神经元进行成像。使用 2 x 2 像素合并可实现更短的曝光时间，同时仍能获得足够的空间分辨率。
      注意:优化激光功率设置以检测荧光变化，范围从 1.2 倍到 4.5 倍不等。
4. 将 10 μl 刺激溶液移液到跗骨段上。再加入 10 μl PBST 用于对照实验。立即获取 117 张刺激后图像。
   注意:获取的刺激后图像数量基于达到荧光最大变化（约 2 分钟）所需的时间。
   1. 关键步骤:在制备物上移液时，请勿用移液器吸头接触门襟，因为这会导致前腿移位。
      注意: 或者，使用显微作器将包含刺激的玻璃毛细管准确定位在靠近待成像的跗骨段附近。根据制造商的说明，使用细胞内显微注射分配器提供受控体积的刺激。

图 1:安装活苍蝇对前腿或长鼻神经元进行成像。（A） 安装前腿:活雄蝇的 3.2 倍图像，显示前腿用胶带固定在盖玻片上。（B） 苍蝇的 40 倍图像显示了每个跗节段 （T1-5） 以及第一跗节段上方和第五跗节段上的胶带位置。（C） 安装长鼻:在喙上放置一条胶带，露出长鼻的尖端。（D） 用于添加刺激的移液器吸头保持在门襟上方，不直接接触制剂。

表 1:CH503 在各种溶剂中的溶解度。 DMSO:二甲基亚砜。乙醇、己烷和 DMSO 溶液用 dH2O （v/v） 稀释。CH503 在 0.2% DMSO 中的溶解度仅限于 250 ng/ml。单独使用溶剂时 ΔF/F 的增加与用信息素刺激时观察到的增加相当。