从感觉神经元中检测生理反应 果蝇

摘要

来源：Shankar, S., 等. 测量生理反应 果蝇 利用活细胞钙成像技术研究感觉神经元对脂质信息素的响应 视频实验杂志 (2016).

本视频演示了一种利用配体结合和荧光成像技术检测黑腹果蝇（Drosophila）感觉神经元反应的方法。配体与神经元受体结合后，引发钙离子内流。钙离子与指示剂复合物结合，从而产生荧光信号，证实神经元对配体产生了反应。

方案

1. 样品制备

1. 将 Gal4 驱动品系与 UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster 果蝇（w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40）杂交。将杂交后代在 25 °C 下培养。
   注意： 使果蝇携带多个 Gal4 或 UAS-GCaMP 转基因拷贝有助于增强荧光信号强度。UAS-GCaMP 转基因的早期版本（UAS-GCaMP3）在 Gr68a-Gal4 驱动子控制下表达时，荧光强度非常弱。
   1. 收集羽化后不久的成年果蝇，并按性别分开，在 25 °C 下继续培养。
      ​注意： GCaMP5G 荧光的基础水平在 14 至 28 天龄的果蝇中最为理想。按性别分离果蝇可避免可能影响神经反应的社会性相互作用。
2. 用轻微气流的 CO₂ 麻醉一只果蝇。
3. 将盖玻片（厚度 0.17 mm）中心滴一滴指甲油，然后轻轻将果蝇侧放在指甲油液滴上，确保果蝇完全覆盖该液滴，从而将其固定在玻璃盖玻片上。
4. 在解剖体视显微镜下进行步骤 1.5 和 1.6，放大倍数设为 8X。
5. 使用湿润的画笔伸展果蝇的前足，并用两条细胶带分别固定第一和第五跗节段（图 1A），以暴露用于成像的第二至第四跗节段（T2-T4）（图 1B）。
6. 若要对喙部神经元进行成像，可在喙部上方贴一条细胶带，以暴露唇瓣（图 1C, D）。
7. 使用 PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶）笔在果蝇周围画出疏水屏障，防止溶液在盖玻片表面流动。固定后应在 30 分钟内开始测量。

2. 刺激溶液的制备

1. 将亲脂性配体（如本研究中使用的CH₅0₃）稀释于PBST（含Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水）溶液中：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、0.1% Triton X-100（v/v）；pH 7.4。
   1. 使用PBST配制1 mg/ml的配体储备液。后续所有稀释均使用PBST对储备液进行。
      注意：根据目标配体的溶解度，可能需要使用不同的溶剂进行溶解。表1描述了CH₅0₃在不同溶剂中的溶解性。与其他溶剂不同，PBST不会增强荧光信号。

3. 味觉神经元的刺激与图像采集

1. 使用10 µl移液器，将10 µl PBST滴加到跗节段上。
   注意：此步骤可湿润腿部，防止跗节段发生漂移。
2. 使用配备有足够速度和灵敏度相机的光学系统，以在高时间分辨率下获得良好的荧光信号。
   注意：在本研究中，我们使用了转盘共聚焦显微镜和sCMOS相机（见材料清单）。
3. 选择需要成像的特定跗节段和神经元。采集三组刺激前共聚焦Z轴层扫图像。
   1. 理想情况下，应使用足够快的采集参数，以实现最大时间分辨率，同时仍能完整捕获整个细胞体积。示例采集参数如下：曝光200毫秒，2 × 2 binning，6层0.5 µm间距的光学切片，每2秒采集一次。
      ​注意：固定后的腿部在30秒间隔下连续成像长达10分钟，未观察到GCaMP信号明显漂白。对于更长时间的记录，需确保腿部在盖玻片上被牢固固定。
   2. 优化激光功率，在整个成像过程中实现尽可能高的信噪比，同时最小化光漂白。在本实验中，使用491 nm二极管激光器（100 mW），透射率设为30%，用于成像腿部和喙器上的Gr68a和ppk23味觉神经元。采用2 × 2 binning，可在保持足够空间分辨率的同时缩短曝光时间。
      注意：激光功率设置已优化，可检测到荧光信号增加1.2至4.5倍的变化。
4. 用移液器将10 µl刺激溶液滴加到跗节段上。在对照实验中，则加入10 µl PBST。立即采集117帧刺激后图像。
   注意：刺激后图像的采集数量基于达到最大荧光变化所需的时间（约2分钟）。
   1. 关键步骤：向样品滴加溶液时，切勿让移液器吸头接触果蝇，否则会导致前腿移位。
      注意：也可使用显微操作器，将装有刺激物的玻璃毛细管精确地定位至待成像的跗节段附近。根据制造商说明，使用细胞内微注射分配器递送可控体积的刺激物。

结果

图1：活体果蝇前足或喙神经成像的固定方法。 （A）前足固定：一只活体雄性果蝇的3.2倍图像，显示前足用胶带固定在盖玻片上。（B）果蝇的40倍图像，显示各跗节段（T1-5）以及胶带位于第一跗节段上方和第五跗节段上的位置。（C）喙部固定：一段胶带覆盖在吻部之上，以暴露喙的尖端。（D）用于施加刺激的移液器尖端置于果蝇上方稍高处，不与样品直接接触。

表1：CH₅0₃ 在不同溶剂中的溶解度。DMSO：二甲基亚砜。乙醇、己烷和DMSO溶液均用dH2O（v/v）稀释。CH503在0.2% DMSO中的溶解度仅限于250 ng/ml...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gr68a-Gal4			由 H. Amrein（美国德克萨斯州 A&M 健康科学中心，德克萨斯州，美国）和 J. Carlson（耶鲁大学，康涅狄格州，美国）惠赠
ppk23-Gal4			由 K. Scott（美国加利福尼亚大学伯克利分校，加利福尼亚州，美国）惠赠
UAS-GCaMP5		42037	布卢明顿果蝇品系中心
0.17 mm 盖玻片（Gold-Seal 盖玻片）	电子显微镜服务公司	63790-10
指甲油，"Hard as Nails Clear"	Sally Hansen
绘图笔	西格玛-奥德里奇公司	Z377821
画笔			细头刷
胶带	Scotch 品牌
吐温 X-100	西格玛-奥德里奇公司	13021
乙醇，实验级	默克公司	10094
正己烷，HPLC 级	西格玛-奥德里奇公司	H303SK-4
DMSO	西格玛-奥德里奇公司	472301
PBST			配方见实验方案部分
CH503			合成方法见 Mori 等人，2010 年
sCMOS 相机（ORCA Flash4.0）	滨松光子学公司	C11578-22U
显微镜（Ti-Eclipse）	尼康公司	Ni-E
转盘扫描头	横河电机公司	CSU-X1-A1