光遗传学刺激与大鼠脑片突触事件的电生理记录

摘要

来源：Kinnavane, L., 等. 离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性 J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了通过光遗传学刺激内侧前额叶皮层（mPFC）轴突并记录外侧内嗅皮层（LEC）锥体神经元的反应，来研究外侧内嗅皮层（LEC）突触效能的实验方法。该方法结合膜片钳记录与光刺激诱导的突触激活，用于研究突触可塑性。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 电生理学与光遗传学刺激

1. 靶细胞的鉴定
   1. 将脑片置于34 °C的浸没式记录舱中，通过蠕动泵以2 mL/min的流速持续灌注人工脑脊液（aCSF）。使用脑片固定器固定脑片。
   2. 在宽场显微镜下使用斜射红外照明，选择4倍物镜，定位至外侧内嗅皮层（lateral entorhinal cortex, LEC）第5层。测量软脑膜表面至目标层的距离。
      注意： 通过将一个近红外LED置于记录室盖玻片下方约3 mm处，并使其与盖玻片平面成约55°角，实现斜向红外照明。图1B微分干涉对比是一种用于脑片电生理学的替代性且常用的成像技术。
   3. 更换为高倍水浸物镜（40x），识别锥体神经元。用胶带在计算机显示器上标记细胞的位置。
      注意： 锥体神经元具有近似三角形的形态，其顶端树突明显，朝向脑片的软脑膜表面延伸（图2A）。可通过观察细胞核是否无明显凝聚以及细胞质膜是否光滑来评估细胞健康状态。使用宽场荧光显微镜时，通常难以观察到视蛋白-荧光染料融合蛋白对轴突的清晰荧光标记。为可视化轴突投射，可在实验后进行免疫组织化学染色，使用针对视蛋白所连荧光染料的一抗，并用偶联了相同或相似波长荧光染料的二抗进行信号放大。
2. 全细胞膜片钳的形成。​
   1. 使用拉管仪制备硼硅酸盐玻璃微电极，并用过滤后的细胞内记录液灌注（120 mM K-葡萄糖酸盐，40 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸），10 mM KCl（氯化钾），2 mM NaCl（氯化钠），2 mM MgATP（三磷酸腺苷镁），1 mM MgCl₂（氯化镁），0.3 mM NaGTP（三磷酸鸟苷钠），0.2 mM EGTA（乙二醇双四乙酸），0.25% 生物胞素溶于超纯水中，pH 7.25，渗透压 285–300 mOsm）。将灌注好的微电极置于膜片钳放大器头stage的电极夹持器中，确保电极导线与细胞内液接触。
   2. 通过连接在电极夹侧端口的管路，向与之相连的吹嘴（例如去掉活塞的1 mL注射器）用力吹气，以产生正压，并通过关闭管路上的三通阀维持压力。升高显微镜物镜，使液面形成弯月面，将电极插入弯月面中，直至在显微镜下可见。
   3. 在 WinLTP16（或其他采集软件/示波器）中打开封接测试窗口，将放大器置于电压钳模式，施加 5 mV 方波脉冲，以确定移液管电阻是否为 3–6 MΩ。
   4. 用移液管尖端接近并接触已识别的细胞；这应在细胞膜上产生一个压痕（图2A；右侧面板以及移液管电阻的轻微增加（0.1 MΩ）。
   5. 释放正压，通过在吹嘴处施加适度抽吸施加负压；这应导致移液管阻力显著增加>1000 MΩ）。此时可保持压力中性。施加负压，以逐步增加的方式形成压力梯度，直至细胞膜破裂，出现全细胞电容瞬变。
3. 记录光遗传学诱发的突触事件。
   1. 进入电流钳制模式。
      ​注意： 在大多数情况下，长距离突触传递为谷氨酸能性的，因此在接近氯离子反转电位的膜电位下进行记录，可最佳地分离AMPA受体（AMPAR）介导的传递，并最小化前馈抑制（FFI）的测量。氯离子反转电位取决于细胞内记录液和aCSF的组成，可通过Goldman-Hodgkin-Katz方程计算；对于上述溶液，该值为-61.3 mV。第5层LEC锥体神经元的平均静息膜电位为-62 mV，必要时可通过持续电流注入维持在此电位。或者，也可将细胞电压钳制在目标电位。为记录长距离抑制性投射16或记录FFI，应将电压钳制在阳离子反转电位，以分离GABA能性氯离子电导。当在高于动作电位阈值的膜电位下对神经元进行电压钳制时，需使用含电压门控钠通道阻断剂的铯基细胞内溶液，以改善电压钳制效果并防止动作电位的产生（130 mM CsMeSO4（甲烷磺酸铯），10 mM HEPES，8 mM NaCl，5 mM QX 314氯化物，4 mM MgATP，0.5 mM EGTA，0.3 mM NaGTP，0.25% 生物胞素，溶于超纯水，pH 7.25，285–300 mOsm）。
   2. 使用数据采集软件，向LED（发光二极管）驱动器发送晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号，以激活安装的470 nm LED。通过滤光片组和适当的光学元件，将安装的LED导入显微镜光路图1B) 向脑片施加光脉冲 通过 使用40倍物镜诱发光遗传学兴奋性突触后电位（oEPSPs）。
      注意： 光脉冲可施加于胞体周围或树突区域，从而激活轴突及突触前终扣中的视蛋白；研究者也可将物镜移至记录细胞以外的轴突区域，以避免对突触终扣的过度刺激。光诱导兴奋性突触后电位（oEPSP）的最大振幅取决于突触投射的强度、病毒注射的效率以及所使用的视蛋白类型。通过调节光强和/或光照持续时间，可将oEPSP振幅调整至所需水平18；相较于调节LED输出功率，改变光脉冲持续时间（在LED最大输出功率下，典型持续时间为0.2–5 ms，对应光密度为4.4 mW/mm19）可获得更稳定的oEPSP振幅。
   3. 通过递送具有不同刺激间隔的多脉冲光刺激序列，研究突触前释放特性（电压变化）图2E）；在解读光遗传学诱发的神经传递时应谨慎。
   4. 通过重复诱发oEPSPs19或施加配体来研究长时程可塑性。在诱导可塑性前，监测oEPSP振幅5-10分钟以确保其稳定性，随后持续监测直至振幅达到稳定状态（通常为30-40分钟）。
      注意： 目前大多数视蛋白无法在高频率（例如，以100 Hz递送100次刺激，这通常是诱导长时程增强效应LTP所采用的参数）下可靠地引发多个动作电位。
   5. 为确认oEPSPs为单突触传递，可通过将物镜定位在树突分支上并对转导通路进行胞体上刺激，同时在含有0.5 µM河豚毒素（tetrodotoxin）和100 µM氨基吡啶（aminopyridine）的环境中进行刺激。若反应依赖动作电位，河豚毒素的施加将阻断信号传递；随后加入氨基吡啶可部分恢复信号传递，则表明oEPSPs为单突触来源¹⁹,²⁰。
   6. 为使生物胞素充分填充神经元，在建立全细胞记录模式后，至少等待15分钟。在电压钳模式下，监测膜电容和输入电阻。
   7. 缓慢沿进针角度将移液管从细胞胞体处撤出，观察电容瞬变和膜电流逐渐消失，表明细胞膜重新封闭，并在移液管尖端形成外向外出膜片。注意记录脑片的方向以及细胞在脑片中的位置。将脑片放入含有PFA（多聚甲醛）的24孔板中，4 °C过夜孵育，随后转移至0.1 M PB中。
      ​注意： 切片可保存长达一周。若需更长时间保存，应定期更换磷酸缓冲液（PB），或使用含叠氮化钠的磷酸缓冲液（含0.02%–0.2%叠氮化钠）。

结果

图1：用于可视化全细胞记录、光遗传学刺激及鉴定tdTomato阳性神经元的脑片收集室与光学配置 (A) 切片收集室14由一个微型离心管架粘附在尼龙网片上定制而成，并置于烧杯中，使其浸没于aCSF中（B用于激发ChR2（通道视紫红质-2）(470 nm) 和 tdTomato (565 nm) 的LED，通过一个非球面聚光镜以准直光线；565 nm的光束经过带通滤光片，以实现tdTomato激发光与发射光光谱的分离。这些光路通过一个长通二向色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三通鲁尔阀	Cole-Parmer	WZ-30600-02
40倍物镜	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-氨基吡啶	Hello Bio	HB1073
4倍物镜	Olympus	PLN4X/0.1
消色差透镜	Edmund Optics	49363	聚焦可见光谱和近红外光
台式微量离心机	Benchmark Scientific	C1005*
生物胞素	Sigma-Aldrich	B4261
硼硅酸盐玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-6
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C5670
相机 - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
卡巴胆碱	Tocris	2810
氯己定外科洗手液	Vetasept	XHG008
电动剪毛器	Andis	22445	AGC Super 2速可拆卸刀头剪毛器
准直聚光镜	ThorLabs	ACL2520-A
盖玻片	Fisher Scientific Ltd	10011913
冷冻切片机	Leica	CM3050 S
CsMeSO₄	Sigma-Aldrich	C1426
氰基丙烯酸酯胶水	Rapid Electronics Ltd	84-4557
数据采集设备	National Instruments	USB-6341 BNC
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
500 nm 长通二向色镜	Edmund Optics	69899
600 nm 长通二向色镜	Edmund Optics	69901
二向色镜立方体	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
带侧端口的电极夹持器	HEKA	895150
发射滤光片	Chroma	59022m
激发滤光片	Chroma	ET570/20x
眼用凝胶	Dechra	Lubrithal
细毛刷	Scientific Laboratory Supplies	BRU2052
断头器	World Precision Instruments	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
异氟烷	Henry Schein	988-3245
异戊烷	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	G4500
运动学荧光滤光立方体	ThorLabs	DFM1T1
LED驱动器	ThorLabs	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO₄	Sigma-Aldrich	M7506
微电极拉制仪	Sutter instruments	P-87
微量注射器	Hamilton	7634-01/00
微量注射器针头	Hamilton	7803-05	定制规格：33号，长度15 mm，尖端类型4 - 12°
微量注射泵	World Precision Instruments	UMP3T-1
安装式蓝色LED	ThorLabs	M470L5
Na₂HPO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S0751
NaH₂PO₄·H₂O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM	SFH4550	用于切片的折射红外成像，微分干涉差（DIC）光学是另一种常用方法
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
膜片钳放大器	Molecular Devices	700A
蠕动泵	World Precision Instruments	Ministar
聚-L-赖氨酸包被的载玻片	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
记录浴槽	Warner Instruments	RC-26G
切片固定锚	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
用于微型钻头的立体定位夹具	Harvard Apparatus	75-1874
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
手术显微镜	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
细胞内记录液用注射器滤器	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
直立式荧光显微镜	Leica	DM6 B
溶液
aCSF
蔗糖切割液
PFA