微电极介导的果蝇幼虫神经细胞中的 FM 染料加载和卸载

摘要

来源:Kopke， D. L.， et al.， FM 染料在突触处循环:比较高钾去极化、电和通道视紫红质刺激。J. Vis. Exp. （2018）

在本视频中，果蝇幼虫神经纤维浸入与细胞膜脂质结合的 FM 染料中。抽吸微电极和电脉冲刺激内吞过程，将 FM 染料掺入新形成的内吞囊泡中。这种方法可视化了神经传递的突触前阶段，可用于研究突触功能和神经递质释放。

方案

1. 幼虫胶解剖

将
1. 10 份有机硅弹性体基料与 1 份弹性体套件中的有机硅弹性体固化剂充分混合。
2. 用弹性体涂覆 22 x 22 mm 的玻璃盖玻片，并在 75 °C 的热板上固化数小时（直到不再粘稠）。
3. 将单个弹性体涂层玻璃盖玻片放入定制的有机玻璃解剖室中，用于幼虫解剖。
4. 使用标准微电极拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管制备胶水移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
5. 轻轻折断微量移液器吸头，然后在另一端连接 2 英尺长的柔性塑料管（1/32 英寸内径，内径;3/32 英寸外径，外径;1/32 英寸壁;带嘴配件（P2 移液器吸头）。
6. 为了准备幼虫解剖，在一个小容器（0.6 mL Eppendorf 管盖）中加入小体积 （~20 μL） 的胶水。
7. 用盐水（以 mM 为单位）填充腔室:128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70 蔗糖和 5 2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸 （HEPES） pH 7.2。
8. 添加与 Alexa Fluor 647 偶联的辣根过氧化物酶 （HRP） 抗体（抗 HRP:647;从 1 mg/mL 原液中以 1:10 稀释），用于在解剖过程中标记 NMJ 突触前末梢21,22。
9. 使用细画笔（2 号），从食品小瓶中取出游荡的第三龄，并将其放在涂有弹性体的盖玻片上。
10. 使用带有附件的嘴产生的负气压，用少量胶水填充玻璃微量移液器吸头（步骤 1.5）。
11. 用镊子将幼虫背面朝上放置，并使用口腔正压用一小滴胶水将头部粘在弹性体涂层的盖玻片上。
12. 对幼虫的后端重复此过程，确保动物在两个胶水附件之间被拉紧。
13. 使用剪刀（刀片 3 毫米），在后部进行水平切割 （~1 mm），并沿背中线进行垂直切割。
14. 使用细镊子 （#5），轻轻去除覆盖肌肉组织的背气管、肠道、脂肪体和其他内脏器官。
15. 对四个体壁襟翼重复胶合程序;轻轻地水平和垂直拉伸体壁。
16. 用镊子提起腹侧神经索 （VNC），用剪刀小心地剪断运动神经，然后完全去除 VNC。
17. 要停止 SV 循环，请用不含 Ca²⁺ 的盐水替换解剖盐水（与上述不含 CaCl₂ 的解剖盐水相同）。

2. 电刺激 FM 染料负载

1. 使用微电极拉拔器准备吸液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
2. 用微锻造器对微电极尖端进行火抛光，直到可以紧密配合地吸起单个运动神经。
3. 将吸液管滑到显微作器上的电极支架上，并将其连接到长柔性塑料管和注射器上。
4. 设置刺激器参数（例如，15 V、20 Hz 频率、20 ms 持续时间以及 5 分钟或 1 分钟的时间。
在
5. 电生理学装置中，用上述 FM1-43 盐水（4 μM;1 mM CaCl₂）替换幼虫制剂中的不含 Ca²⁺ 的盐水。
6. 将制剂放在显微镜载物台上并升高载物台，直到幼虫和吸液管聚焦（40X 水浸物镜）。
7. 用注射器产生的负气压将支配所选半段的一圈切断的运动神经吸到抽吸电极中。
8. 通过短暂的刺激测试抽吸电极功能，同时目视监测所选半节的肌肉收缩。
9. 使用选定的参数（步骤 2.4）刺激运动神经以驱动 SV 内吞作用和 FM1-43 染料摄取。
10. 用不含 Ca²⁺ 的生理盐水（5 次，1 分钟）快速洗涤以完全去除 FM1-43 染料溶液。
11. 将幼虫制剂保存在新鲜的不含 Ca^{2 +} 的盐水中，以便使用上方的共聚焦成像方案进行即时成像。
12. 仔细记下 NMJ 图像（节段、侧面和肌肉），以确保在 FM 染料卸载后获得相同的 NMJ。

材料