微电极介导的FM染料加载与卸载 果蝇 幼虫神经细胞

摘要

来源：Kopke, D. L.，等，突触处的FM染料循环：比较高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中， 果蝇 幼虫神经纤维浸入FM染料中，该染料可结合细胞膜脂质。通过吸吮微电极施加电脉冲，刺激内吞过程，使FM染料被纳入新形成的内吞囊泡中。该方法可可视化神经递质传递的突触前阶段，适用于研究突触功能及神经递质释放。

方案

1. 幼虫胶质解剖

1. 将弹性体试剂盒中的10份硅酮弹性体基础剂与1份硅酮弹性体固化剂充分混合。
2. 将22 × 22 mm玻璃盖玻片涂覆弹性体，并在75℃热板上固化 ˚C 放置数小时（直至触摸不再发黏）。
3. 将一片涂有弹性体的玻璃盖玻片放入自制的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）解剖室中，用于幼虫解剖。
4. 使用标准的微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管制成胶粘剂移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
5. 轻轻折断微量移液器吸头，在另一端连接一段2英尺长的柔性塑料管（内径1/32英寸，外径3/32英寸，管壁厚度1/32英寸），并配有口部接头（P2移液器吸头）。
6. 在进行幼虫解剖前，用一个小容器（0.6 mL 离心管管盖）装入少量液体（约 20 μL） µ胶的升（L）。
7. 用生理盐水填充室腔（单位：mM）：128 NaCl，2 KCl，4 MgCl₂₂，1 CaCl₂70 蔗糖和 5 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES) pH 7.2
8. 加入与Alexa Fluor 647偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）抗体（anti-HRP:647；将1 mg/mL储备液稀释10倍）以在解剖过程中标记神经肌肉接头（NMJ）的突触前终末21,22。
9. 使用细毛画笔（2号）从培养瓶的食物中取出一只游走期三龄幼虫，置于涂有弹性体的盖玻片上。
10. 使用口吸装置产生的负压（步骤1.5），将少量胶水吸入玻璃微电极尖端。
11. 用镊子将幼虫背侧朝上放置，借助口部施加正压空气，用一小滴胶将幼虫头部粘附到涂有弹性体的盖玻片上。
12. 用胶水将幼虫后端固定，重复此操作，确保幼虫在两个粘附点之间被充分拉直。
13. 使用剪刀（刀片3 mm），在后部做一水平切口（约1 mm），并沿背侧中线做一纵向切口。
14. 使用精细镊子（#5）轻轻移除覆盖肌肉组织的背侧气管、肠道、脂肪体及其他内部器官。
15. 对四个体壁瓣重复粘贴步骤；轻柔地水平和垂直拉伸体壁。
16. 用镊子提起腹神经索（VNC），小心地用剪刀切断运动神经，然后完全移除腹神经索。
17. 为终止SV循环，用Ca替换灌流液中的生理盐水²⁺无钙盐水（与上述解剖用盐水相同，但不含 CaCl₂）₂).

2. 电刺激FM染料负载

1. 使用微电极拉制仪制备吸液移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
2. 使用微电极拉制仪将微电极尖端进行火焰抛光，直至其能够紧密吸附单根运动神经。
3. 将吸液移液管滑入安装在显微操作器上的电极夹持器，并连接至长的柔性塑料管和注射器。
4. 设置刺激器参数（例如15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，作用时间为 5 分钟或 1 分钟。
5. 更换 Ca²⁺-用上述含FM1-43的生理盐水替换幼虫制备中的无染料生理盐水（4 µM；1 mM CaCl₂电生理实验装置中
6. 将样品置于显微镜载物台上，升高载物台，直至幼虫和吸管在40倍水浸物镜下聚焦。
7. 用注射器产生的负压将支配所选半节段的切断运动神经环吸入吸电极中。
8. 在选定的半体节中，通过短脉冲刺激测试吸吮电极功能，同时肉眼观察肌肉收缩情况。
9. 使用选定的参数（步骤 2.4）刺激运动神经，以驱动突触小泡内吞作用及 FM1-43 染料摄取。
10. 用 Ca 快速洗涤²⁺无染料生理盐水（5次，每次1分钟）以彻底去除FM1-43染料溶液。
11. 将幼虫样本保存在新鲜的 Ca 中²⁺使用上述共聚焦成像方案，立即用无菌生理盐水进行成像。
12. 仔细记录神经肌肉接头（NMJ）图像的位置信息（包括节段、侧别和肌肉），以确保在FM染料卸载后能够重新定位到同一NMJ。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SylGard 184 硅胶弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388	用于覆盖在盖玻片上以进行解剖
显微镜盖玻片 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	用于承载 SylGard 以进行解剖
铝制顶板加热板 Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	用于固化 SylGard
聚甲基丙烯酸甲酯解剖腔室	N/A	N/A	手工制作
硼硅酸盐玻璃毛细管	WPI	1B100F-4	用于制作吸管和胶合微电极
基于激光的微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-2000	用于制作吸管和胶合微电极
Tygon E-3603 实验室管路	Component Supply Co.	TET-031A	用于口吸管和吸液微管
P2 移液器吸头	USA Scientific	1111-3700	用于口吸管
0.6 mL Eppendorf 管盖	Fisher Scientific	05-408-120	用于盛放解剖用胶
Vetbond 3M	WPI	vetbond	用于解剖的胶水
氯化钾	Fisher Scientific	P-217	用于生理盐水配制
氯化钠	Millipore Sigma	S5886	用于生理盐水配制
氯化镁	Fisher Scientific	M35-500	用于生理盐水配制
二水合氯化钙	Millipore Sigma	C7902	用于生理盐水配制
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	用于生理盐水配制
HEPES	Millipore Sigma	H3375	用于生理盐水配制
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	用于标记神经元膜
画笔	Winsor & Newton	94376864793	用于操作幼虫
Dumont Dumostar 镊子 #5	WPI	500233	解剖过程中使用
7 cm McPherson-Vannas 显微剪刀（刀片 3 mm）	WPI	14177	解剖过程中使用
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	荧光苯乙烯染料
数字计时器	VWR	62344-641	用于计时 FM 染料加载/卸载过程
微电极抛光仪	WPI	MF200	用于烧制抛光玻璃微电极
20 mL 滑动式注射器针头	BD	301625	用于吸取轴突以进行电刺激
微操纵器（磁性底座）	Narishige	MMN-9	用于控制电刺激用的吸电极
刺激器	Grass	S48	用于控制 LED 和电刺激
Zeiss Axioskop 显微镜	Zeiss		电刺激过程中使用
40X Achroplan 水浸物镜	Zeiss		用于电刺激和共聚焦成像
带相机接口的 Zeiss Stemi 显微镜	Zeiss	2000-C	用于视蛋白刺激
T-Cube LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于控制 LED
LED 电源	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	为 LED 提供电力
光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	用于测量 LED 强度