分析突触小泡再循环及荧光染料摄取 果蝇 幼虫

摘要

来源：Kopke, D. L.，等，突触处的 FM 染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种利用荧光染料研究表达光敏通道蛋白的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头处突触小泡循环的实验方案。蓝光激活光敏通道蛋白，引发钙离子内流及突触小泡的胞吐作用。该染料可嵌入神经元膜中，并在内吞过程中被摄入，从而增强荧光信号。进一步的蓝光刺激可诱导胞吐作用并释放染料，表现为荧光强度减弱。

方案

1. 幼虫胶解剖

1. 将 10 份有机硅弹性体基料与弹性体套件中的 1 份有机硅弹性体固化剂充分混合（材料表）。
2. 用弹性体涂覆 22 x 22 mm 的玻璃盖玻片，并在 75 °C 的热板上固化数小时（直到不再粘稠）。
3. 将单个弹性体涂层的玻璃盖玻片放入定制的有机玻璃解剖室（图 1，底部）中，为幼虫解剖做准备。
4. 使用标准微电极拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管制备胶水移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
5. 轻轻折断微量移液器吸头，然后在另一端连接 2 英尺长的柔性塑料管（1/32 英寸内径，内径;3/32 英寸外径，外径;1/32 英寸壁;材料表）带嘴配件（P2 移液器吸头）。
6. 在小容器（0.6 mL Eppendorf 管盖）中加入小体积 （~20 μL） 的胶水（材料表），以准备幼虫解剖。
7. 用盐水（以 mM 为单位）填充腔室:128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70 蔗糖和 5 2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸 （HEPES） pH 7.2。
8. 添加与 Alexa Fluor 647 偶联的辣根过氧化物酶 （HRP） 抗体（抗 HRP:647;从 1 mg/mL 原液中以 1:10 稀释），用于在解剖过程中标记神经肌肉接头 （NMJ） 突触前末梢。
9. 使用细画笔（2 号），从食品瓶中取出游荡的第三龄幼虫，并将其放在涂有弹性体的盖玻片上。
10. 使用带有附件的嘴产生的负气压，用少量胶水填充玻璃微量移液器吸头（步骤 1.5）。
11. 用镊子将幼虫背侧朝上放置，并使用口腔正压用一小滴胶水将头部粘在弹性体涂层的盖玻片上。
12. 对幼虫的后端重复此过程，确保动物在两个胶水附件之间被拉紧。
13. 使用剪刀（刀片 3 毫米;材料表），在后部进行水平切割 （~1 mm），并沿背中线进行垂直切割。
14. 使用细镊子（#5，材料表），轻轻去除覆盖肌肉组织的背气管、肠道、脂肪体和其他内脏器官。
15. 对四个体壁挡板重复粘合程序，确保水平和垂直轻轻拉伸体壁。
16. 用镊子提起腹侧神经索 （VNC），用剪刀小心地剪断运动神经，然后完全取出 VNC。
17. 用不含 Ca²⁺ 的生理盐水代替解剖盐水（与上述不含 CaCl₂ 的解剖盐水相同）以停止突触囊泡 （SV） 循环。

2. 成像:共聚焦显微镜

1. 使用带有 40 倍水浸物镜的正置共聚焦显微镜对 NMJ 染料荧光进行成像（可以使用其他显微镜）。
2. 对腹部节段 2-4 的肌肉 4 NMJ 进行成像（可以对其他 NMJ 进行成像）并使用适当的软件（材料表）收集图像。
3. 使用氦氖 633 nm 激光器激发 HRP:647（使用长通滤光片> 635 nm），使用氩 488 nm 激光器激发 FM1-43（使用带通滤光片 530-600 nm）。
4. 在作上确定两个通道的最佳增益和偏移。
   注意:这些设置将在实验的其余部分保持不变。
5. 从突触末梢的 HRP 标记的顶部到底部，将共聚焦 Z 堆栈穿过整个选定的 NMJ。
6. 仔细记下成像的 NMJ（节段、侧面和肌肉），以确保在 FM 染料卸载后过量到完全相同的 NMJ。

3. 通道视紫红质刺激 FM 染料负载

1. 在含有 ChR2 辅因子全反式视黄醇（溶于乙醇;终浓度 100 μM）的食物上培养表达 ChR2 的幼虫。
2. 将幼虫制剂放在配备有相机端口的解剖显微镜载物台上的有机玻璃室中。
3. 连接蓝色 LED （470 nm;材料表）使用同轴电缆连接到可编程刺激器，并将 LED 放入相机端口。
4. 使用显微镜变焦功能将蓝色 LED 光束聚焦到解剖的幼虫功能上。
5. 在光遗传学阶段，用上述 FM1-43 盐水（4 μM;1 mM CaCl₂）替换幼虫制剂上的不含 Ca²⁺ 的盐水。
6. 使用刺激器设置 LED 参数（例如，15 V、20 Hz 频率、20 ms 持续时间和 5 分钟时间（图 2））。
7. 开始光刺激并使用计时器跟踪光遗传学刺激期的预定持续时间（例如，5 分钟;图 2）。
8. 当计时器停止时，快速去除 FM 染料溶液并更换为不含 Ca²⁺ 的生理盐水以停止 SV 循环。
9. 用不含 Ca²⁺ 的生理盐水（5 次，每次 1 分钟）快速连续洗涤，以确保 FM 染料溶液完全去除。
10. 将幼虫制剂保存在新鲜的不含 Ca^{2 +} 的盐水中，以便使用成像方案使用共聚焦显微镜立即成像。
11. 仔细记下成像的 NMJ（节段、侧面和肌肉），以确保在 FM 染料卸载后获得完全相同的 NMJ。

4. 通道视紫红质刺激:FM 染料卸载

1. 在解剖显微镜载物台上用普通盐水（不含 FM1-43 染料）替换不含 Ca²⁺ 的盐水，相机端口 LED 聚焦在幼虫上。
2. 设置用于卸载的刺激器参数（例如，15 V、20 Hz 频率、20 ms 持续时间和 2 分钟的时间（图 2）。
3. 开始光刺激并使用计时器跟踪光遗传学刺激期的预定持续时间（例如，2 分钟;图 2）。
4. 计时器周期结束后，快速去除 FM 染料溶液并更换为不含 Ca²⁺ 的生理盐水以停止 SV 循环。
5. 用不含 Ca²⁺ 的盐水（5 次，每次 1 分钟）快速连续洗涤，以确保完全去除外部染料。
6. 将幼虫制剂保存在新鲜的不含 Ca^{2 +} 的盐水中，以便立即使用共聚焦显微镜成像。
7. 确保使用相同的共聚焦设置在上述相同的 NMJ 下对 FM1-43 染料荧光进行成像。

结果

图1：果蝇NMJ中FM1-43染料加载实验流程图。 幼虫胶粘解剖可获得一个扁平化的神经肌肉标本，腹神经索（VNC）从腹侧中线（Vm）发出节段性神经，连接到体壁肌肉阵列的半节段重复结构（步骤a）。将VNC切断游离后，将整个幼虫解剖标本浸入粉红色FM1-43溶液（4 µM）中，准备进行刺激（步骤b）。随后采用选定的刺激模式加载FM1-43染料（步骤3），可选方式包括：高[K⁺]去极化处理整个幼虫（cI）、单根运动神经的吸吮电极刺激（cII），或光驱动高度靶向的通道视紫红质激活（cIII）。使用无Ca²⁺生理盐水终止FM1-43的摄取，并对染料标记的NMJ进行成像（步骤d）。随后在浴液中去除FM1-43，进行第二次刺激，以诱导突触小泡的胞吐释放染...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SylGard 184 硅胶弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388	用于覆盖在盖玻片上以进行解剖
显微镜盖玻片 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	用于承载 SylGard 以进行解剖
铝制顶板加热板 Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	用于固化 SylGard
聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）解剖室	N/A	N/A	手工制作
硼硅酸盐玻璃毛细管	WPI	1B100F-4	用于制作吸管和胶合微电极
基于激光的微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-2000	用于制作吸管和胶合微电极
Tygon E-3603 实验室软管	Component Supply Co.	TET-031A	用于口吸管和吸力微电极
P2 移液器吸头	USA Scientific	1111-3700	用于口吸管
0.6 mL Eppendorf 管盖	Fisher Scientific	05-408-120	用于盛放解剖用胶
Vetbond 3M	WPI	vetbond	用于解剖的胶水
氯化钾	Fisher Scientific	P-217	用于生理盐水配制
氯化钠	Millipore Sigma	S5886	用于生理盐水配制
氯化镁	Fisher Scientific	M35-500	用于生理盐水配制
二水合氯化钙	Millipore Sigma	C7902	用于生理盐水配制
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	用于生理盐水配制
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	用于标记神经元膜
HEPES	Millipore Sigma	H3375	用于生理盐水配制
画笔	Winsor & Newton	94376864793	用于操作幼虫
Dumont Dumostar 镊子 #5	WPI	500233	解剖过程中使用
7 cm McPherson-Vannas 显微剪刀（刀片 3 mm）	WPI	14177	解剖过程中使用
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	荧光苯乙烯染料
数字计时器	VWR	62344-641	用于计时 FM 染料的加载/卸载
LSM 510 META 激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss		用于荧光标记物成像
Zen 2009 SP2 版本 6.0	Zeiss		共聚焦成像软件
HeNe 633 nm 激光器	Lasos	用于成像过程中激发 HRP:647
氩离子 488 nm 激光器	Lasos		用于成像过程中激发 FM 染料
微电极抛光仪（Micro-Forge）	WPI	MF200	用于火焰抛光玻璃微电极
刺激器	Grass	S48	用于控制 LED 和电刺激
全反式视黄醛	Millipore Sigma	R2500	ChR2 的必需辅因子
带相机接口的 Zeiss Stemi 显微镜	Zeiss	2000-C	用于视蛋白通道刺激实验
470 nm LED	ThorLabs	M470L2	用于激活 ChR
T-Cube LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于控制 LED
LED 电源	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	为 LED 提供电力
光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	用于测量 LED 强度
40X Achroplan 水浸物镜	Zeiss	用于电刺激和共聚焦成像过程中