分析突触小泡循环与荧光染料摄取 黑腹果蝇 幼虫

摘要

来源：Kopke, D. L.，等，突触处的FM染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较。 J. Vis. Exp. （2018）。

本视频演示了一种利用荧光染料研究表达光敏通道蛋白的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头处突触小泡循环的实验方案。蓝光激活光敏通道蛋白，引发钙离子内流及突触小泡的胞吐作用。荧光染料嵌入神经元膜中，并在内吞过程中被摄入，导致荧光增强。随后的蓝光刺激诱导胞吐作用并释放染料，表现为荧光信号减弱。

方案

1. 幼虫胶质解剖

1. 将弹性体试剂盒中的10份硅酮弹性体基础剂与1份硅酮弹性体固化剂充分混合（材料表).
2. 将 22 × 22 mm 玻璃盖玻片用弹性体包被，并在 75 °C 热板上固化 ˚C，数小时，直至触摸时不发粘。
3. 将一片带有弹性涂层的玻璃盖玻片放入定制的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）解剖室中（图1，底部）以备幼虫解剖。
4. 使用标准微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管制成胶粘剂移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
5. 轻轻折断微量移液器尖端，并在另一端连接一段长约2英尺的柔性塑料管（内径1/32英寸，ID；外径3/32英寸，OD；壁厚1/32英寸） 材料表）配嘴（P2 吸头）。
6. 用一个小容器（0.6 mL 离心管管盖）装取少量液体（约 20 μL） μ胶的 L）（材料表）以备进行幼虫解剖。
7. 用生理盐水填充室腔（单位：mM）：128 NaCl，2 KCl，4 MgCl₂₂，1 CaCl₂70 蔗糖和 5 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES) pH 7.2
8. 加入与Alexa Fluor 647偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）抗体（anti-HRP:647；从1 mg/mL原液稀释1:10），用于在解剖过程中标记神经肌肉接头（NMJ）的突触前终末。
9. 使用细毛笔（2号）从培养瓶的食物中取出一只游走期三龄幼虫，置于涂有弹性体的盖玻片上。
10. 使用口吸装置产生的负压，将少量胶水吸入玻璃微量移液器尖端（步骤1.5）。
11. 用镊子将幼虫背侧朝上固定，借助口部吹气产生的正压，将头部用少量胶水粘附于涂有弹性材料的盖玻片上。
12. 用胶水将幼虫的后端以同样方式固定，确保幼虫在两个粘附点之间被充分拉直。
13. 使用剪刀（刀片3 mm； 材料表在后部做一横向切口（约1 mm），并沿背侧中线做一纵向切口。
14. 使用精细镊子（#5， 材料表），轻轻移除覆盖肌肉组织的背侧气管、肠道、脂肪体及其他内部器官。
15. 对四个体壁瓣重复粘贴操作，注意轻柔地在水平和垂直方向上拉伸体壁。
16. 用镊子提起腹神经索（VNC），小心地用剪刀切断运动神经，然后完全移除腹神经索。
17. 用含钙的任氏液替换灌注液²⁺无钙盐溶液（与上述解剖用盐溶液相同，但不含 CaCl）₂以终止突触小泡（SV）循环。

2. 成像：共聚焦显微镜

1. 使用配备 40X 水浸物镜的直立共聚焦显微镜对 NMJ 染料荧光进行成像（也可使用其他显微镜）。
2. 对腹部第 2-4 节段的肌肉 4 NMJ 进行成像（也可成像其他 NMJ），并使用适当的软件（材料表）采集图像。
3. 使用 HeNe 633 nm 激光激发 HRP:647（配备长通滤光片 > 635 nm），使用 Argon 488 nm 激光激发 FM1-43（配备带通滤光片 530-600 nm）。
4. 为两个通道分别操作性地确定最佳增益和偏移。
   注意：这些设置在整个实验的后续过程中将保持不变。
5. 从 HRP 标记的突触终末顶部到底部，对所选 NMJ 进行完整的共聚焦 Z 轴扫描成像。
6. 仔细记录成像的 NMJ（节段、侧别和肌肉），以确保在 FM 染料卸载后能够再次定位到完全相同的 NMJ。

3. 通道视紫红质刺激FM染料负载

1. 在含有ChR2辅因子全反式视黄醛（溶于乙醇；100）的食物上培养表达ChR2的幼虫 μM 终浓度）
2. 将幼虫标本置于配有相机接口的解剖显微镜载物台上的有机玻璃 chamber 中。
3. 连接一个蓝色LED（470 nm； 材料表通过同轴电缆将刺激器连接至可编程刺激器，并将LED插入相机端口。
4. 使用显微镜的变焦功能，将蓝色LED光束聚焦于解剖后的幼虫组织上。
5. 更换 Ca²⁺用上述含FM1-43的生理盐水冲洗幼虫样本 μM；1 mM CaCl₂在光遗传学实验平台上。
6. 使用刺激器设置LED参数（例如，15 V、20 Hz频率、20 ms持续时间，持续5分钟）图2)).
7. 开始光刺激，并使用计时器跟踪预定的光遗传学刺激持续时间（例如，5 min； 图2).
8. 当计时器停止时，迅速移除FM染料溶液，并替换为Ca²⁺用无菌生理盐水终止SV循环。
9. 用 Ca 快速连续洗涤²⁺无荧光染料的生理盐水（5次，每次1分钟），以确保完全去除FM染料溶液。
10. 保持幼虫制备物于新鲜的 Ca²⁺使用成像方案，立即用无菌生理盐水进行共聚焦显微镜成像。
11. 仔细记录所成像的神经肌肉接头（NMJ）位置（节段、侧别及肌肉），以确保在FM染料卸载后能够准确定位到同一NMJ。

4. 通道视紫红质刺激：FM 染料卸载

1. 在解剖显微镜载物台上，将无 Ca²⁺ 盐溶液更换为普通盐溶液（不含 FM1-43 染料），并将相机端口的 LED 光源对准幼虫。
2. 设置刺激器的卸载参数（例如，15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，持续时间为 2 分钟（图 2）。
3. 开始光刺激，并使用计时器记录预定的光遗传学刺激持续时间（例如，2 分钟；图 2）。
4. 当计时结束时，迅速移除 FM 染料溶液，并替换为无 Ca²⁺ 盐溶液以终止突触小泡循环。
5. 用无 Ca²⁺ 盐溶液快速连续冲洗（5 次，每次 1 分钟），确保完全去除外部染料。
6. 将幼虫标本保持在新鲜的无 Ca²⁺ 盐溶液中，立即进行共聚焦显微镜成像。
7. 确保使用相同的共聚焦设置，在上述相同的神经肌肉接头处检测 FM1-43 染料荧光。

结果

图1：果蝇NMJ中FM1-43染料加载实验流程图。 幼虫胶粘解剖可获得一个展平的神经肌肉组织样本，腹神经索（VNC）从腹侧中线（Vm）发出节段性神经，连接到体壁肌肉阵列（步骤a）。将VNC切断后，将整个幼虫解剖样本浸入粉红色FM1-43溶液（4 µM）中，准备进行刺激（步骤b）。随后采用选定的刺激范式加载FM1-43染料（步骤3），可选方式包括：高[K⁺]去极化处理整个幼虫（cI）、单根运动神经的吸电极刺激（cII），或光驱动高度靶向的通道视紫红质激活（cIII）。使用无Ca²⁺生理盐水终止FM1-43的摄取，并对染料标记的NMJ进行成像（步骤d）。随后在浴液中去除FM1-43，进行第二次刺激以诱导突触小泡的胞吐（步骤e）。对同一NMJ再次...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SylGard 184 硅酮弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388	用于覆盖在盖玻片上以进行解剖
显微镜盖玻片 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	用于承载 SylGard 以进行解剖
铝制顶板加热板 Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	用于固化 SylGard
聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）解剖室	N/A	N/A	手工制作
硼硅酸盐玻璃毛细管	WPI	1B100F-4	用于制作吸管和黏合微电极
基于激光的微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-2000	用于制作吸管和黏合微电极
Tygon E-3603 实验室软管	Component Supply Co.	TET-031A	用于口吸管和吸力微电极
P2 移液器吸头	USA Scientific	1111-3700	用于口吸管
0.6 mL Eppendorf 管盖	Fisher Scientific	05-408-120	用于盛放解剖用胶水
Vetbond 3M	WPI	vetbond	用于解剖的黏合剂
氯化钾	Fisher Scientific	P-217	用于生理盐水配制
氯化钠	Millipore Sigma	S5886	用于生理盐水配制
氯化镁	Fisher Scientific	M35-500	用于生理盐水配制
二水合氯化钙	Millipore Sigma	C7902	用于生理盐水配制
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	用于生理盐水配制
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	用于标记神经元膜
HEPES	Millipore Sigma	H3375	用于生理盐水配制
画笔	Winsor & Newton	94376864793	用于操作幼虫
Dumont Dumostar 镊子 #5	WPI	500233	解剖过程中使用
7 cm McPherson-Vannas 显微剪刀（刀片 3 mm）	WPI	14177	解剖过程中使用
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	荧光苯乙烯染料
数字计时器	VWR	62344-641	用于计时 FM 染料的加载/卸载
LSM 510 META 激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss		用于荧光标记物成像
Zen 2009 SP2 版本 6.0	Zeiss		共聚焦成像软件
HeNe 633 nm 激光器	Lasos	用于成像过程中激发 HRP:647
氩离子 488 nm 激光器	Lasos		用于成像过程中激发 FM 染料
微电极抛光仪（Micro-Forge）	WPI	MF200	用于火焰抛光玻璃微电极
刺激器	Grass	S48	用于控制 LED 和电刺激
全反式视黄醛	Millipore Sigma	R2500	ChR2 的必需辅因子
带相机接口的 Zeiss Stemi 显微镜	Zeiss	2000-C	用于视蛋白刺激实验
470 nm LED	ThorLabs	M470L2	用于激活 ChR
T-Cube LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于控制 LED
LED 电源	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	为 LED 提供电力
光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	用于测量 LED 光强
40X Achroplan 水浸物镜	Zeiss	用于电刺激和共聚焦成像过程中