通过刺激大鼠的膈神经来测量复合肌肉动作电位

摘要

来源:Martin， M. et al.膈运动神经元膈肌支配的功能和形态学评估。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频描述了通过膈神经刺激记录大鼠膈肌纤维中的复合肌肉动作电位 （CMAP）。膈神经的高强度电脉冲刺激在膈肌纤维中产生动作电位，通过获得反应曲线来观察。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 准备动物:

1. 使用 1-2% 的吸入剂（异氟醚）给药或注射（氯胺酮、甲苯噻嗪、乙酰丙嗪）麻醉大鼠。注射麻醉剂剂量如下:氯胺酮 95.0 mg/kg，甲苯噻嗪 10.0 mg/kg，乙酰丙嗪 0.075 mg/kg.
   注意:在进行此 CMAP 记录方案时，我们成功地使用了吸入剂和注射麻醉方法，没有偏好。
2. 在手术开始前、手术结束，直到术后丁丙诺啡生效，必须将动物保持在适当的麻醉深度。通过短暂的脚趾捏合确认适当的麻醉，以确定没有引起戒断反应。此外，用棉签测试角膜反射。在整个手术过程中，确定心率和呼吸频率没有增加，这表明麻醉深度变得太浅。
3. 在动物的眼睛上涂抹兽医药膏，以防止麻醉时干燥。
4. 外科医生应在开始手术前用消毒剂（洗必泰磨砂膏）洗手。外科医生应佩戴无菌手套、口罩和长袍或干净的实验室外套。手术前应清洗和高压灭菌所有器械。在器械水平进行高压灭菌之前，在仪器套件内添加灭菌指示条，以验证灭菌是否完成。外科医生应在开始手术前确认条带上的整条线都是黑色的。用指示高压灭菌胶带也用胶带粘在盒子的外面。如果要在同一天对多只动物进行手术，请在手术之间清洁器械并在玻璃珠消毒器中消毒。必要时，将器械手柄放入灭菌器中适当时间，用无菌止血钳取出器械，在无菌区域冷却，然后将器械的功能端放入玻璃珠灭菌器中适当时间，对器械的两端进行消毒。
5. 麻醉动物后，将其放在手术板上，背表面朝下，腹部朝上，以便可以使用胶带将动物的前肢固定在手术板上。
从
6. 颅底开始从头骨底部开始剃除腹面，并确保根据记录的半横膈膜，剃除中线两侧腹部周围的区域。将聚维酮碘涂抹在剃光的皮肤表面。

2. CMAP 录音的准备工作:

1. 动物准备后，将接地电极皮下放入尾部（图 1）。
2. 将参比电极皮下放入对侧下腹部区域。
3. 将导电凝胶放在自粘表面条或圆盘记录电极上（表面条带电极的尺寸:0.5 x 3 cm），然后沿单侧肋缘横向放置表面电极。
4. 经皮放置刺激电极，距气管外侧和锁骨上方 0.5 cm。将电极插入皮肤约 1.0 厘米深处。用手固定电极，使其位置不会随着后续刺激而移动。
   注意:刺激电极相对于插入部位的皮肤成 90° 角。

3. 复合肌肉动作电位 （CMAP） 记录:

1. 使用刺激器/放大器获取电生理记录，然后进行计算机辅助数据分析。
2. 单拉刺激的刺激参数应为 0.5 毫秒、1.0 Hz 超最大脉冲。刺激的幅度应在 6.0 和 8.0 V 之间（图 2A）
   注意:在实验中，在动物之间使用具有相同振幅的刺激强度。目标是通过使用最小的刺激幅度来最大化响应幅度。需要注意的是，刺激时发生的初始反应是刺激伪影。此外，应注意获得 CMAP 反应，在刺激伪影后先获得稳定/平坦的基线，然后是快速 CMAP 反应。为了获得这样的反应，可能需要重新定位刺激和/或记录电极。
3. 在刺激之间等待 30 秒，并连续重复 10 次刺激以获得平均响应（图 2B-C）。测量从基线到峰值的振幅（图 2A）。在动物的呼吸周期阶段进行膈神经刺激，此时膈神经/横膈未激活。对于对侧半膈肌，可以在同一只动物上重复该过程。
4. 在最后一次 CMAP 记录会议后，如果进行膈肌神经肌肉接头 （NMJ） 染色，则灌注动物。大约每周（或以选择的时间间隔）对同一只动物重复进行 CMAP 记录。
5. 在存活 CMAP 记录后，让动物在循环温水加热垫上恢复，并在恢复过程中持续监测，直到醒来并严重卧位。在完全康复之前，请勿将接受过手术的动物送回其他动物的陪伴处。
6. 一旦颅骨卧位，在最初的 48 小时内每 12 小时监测一次动物（此后每天一次）。如果动物出现脱水（皮肤松弛、无精打采），则给予液体（乳酸林格溶液;皮下注射;每次注射 1-2 ml，旋转部位;每天 2 次），直到术后体重和体液流失稳定。如有必要，在术后急性期为动物提供小盘子中的软化食物，以鼓励动物在无法到达金属丝棒盖喂食器时进食。
手术
7. 结束前以 0.05 mg/kg 的剂量施用丁丙诺啡，然后在前 24 小时内间隔 12 小时给药（取决于此后疼痛/压力的迹象）（通过皮下注射（部位旋转）。如果此后发现疼痛或痛苦的迹象，请用丁丙诺啡治疗动物。表明疼痛/痛苦的迹象包括缺乏活动、发声、缺乏饮食或饮水（脱水）、体重过度减轻、肌卫、切口部位过度啃咬或抓挠。用于确定疼痛和痛苦的其他标准包括对外来刺激无反应、短暂或无端发声、呼吸困难或异常、持续红棕色鼻眼分泌物、明显的竖毛。还要监测表明动物生病的不良卫生条件的证据。如果在治疗 72 小时后仍然观察到动物处于痛苦中（根据上述疼痛/压力标准概述，并在接受上述镇痛方案后），请对动物实施安乐死。

结果

图 1:CMAP 电极放置。将接地电极皮下放入尾部。将参比电极放入腹部。表面记录电极沿单侧肋缘横向放置。刺激电极被描绘为红色和黑色。

图 2:CMAP 记录和分析。（A） CMAP 响应的幅度可以从基线到峰值进行测量。典型的 CMAP 响应应同时显示刺激伪影和响应曲线。（B-C）代表性的平均 CMAP 响应。刺激应至少连续进行十次，以获得反应的重复平均值。这里显示的是仅接受椎板切除术的未受伤大鼠 （B...

材料