通过刺激大鼠膈神经测量复合肌肉动作电位

摘要

来源：Martin, M. 等. 膈神经运动神经元对膈肌支配的功能性与形态学评估. J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了通过刺激膈神经在大鼠膈肌纤维中记录复合肌肉动作电位（CMAPs）的方法。对膈神经施加高强度电脉冲刺激，可在膈肌纤维中引发动作电位，并通过获取反应曲线进行观察。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物准备：

1. 使用吸入性麻醉剂（异氟烷）以1-2%浓度给予至起效，或通过注射给药（氯胺酮、赛拉嗪、乙酰丙嗪）对大鼠进行麻醉。注射麻醉剂的剂量如下：氯胺酮95.0 mg/kg，赛拉嗪10.0 mg/kg，乙酰丙嗪0.075 mg/kg。
   注意：在执行本CMAP记录方案时，我们成功使用了吸入性和注射性两种麻醉方法，且无明显偏好。
2. 手术开始前直至手术结束，并持续到术后布托啡诺起效期间，必须维持动物处于适当的麻醉深度。通过短暂捏压脚趾以确认无回缩反应，从而判断麻醉是否充分。此外，使用棉签检测角膜反射。在整个手术过程中，应确保心率和呼吸频率未升高，否则提示麻醉深度已变浅。
3. 在动物麻醉期间，应在眼部涂抹兽医专用眼膏，以防止角膜干燥。
4. 术者在开始手术前应使用消毒剂（洗必泰擦洗剂）洗手。术者应穿戴无菌手套、口罩及无菌手术衣或洁净实验服。所有手术器械应在手术前清洗并高压灭菌。在高压灭菌前，将灭菌指示条置于器械包内与器械同一水平位置，以验证灭菌是否完成。术者在开始手术前应确认指示条整条变为黑色。同时，也应使用指示性高压灭菌胶带封贴器械盒外部。若同一天需对多只动物进行手术，应在每次手术之间清洁器械，并使用玻璃珠灭菌器进行灭菌。必要时，可通过将器械手柄端放入玻璃珠灭菌器中适当时间进行灭菌，然后用无菌止血钳取出，在无菌区域冷却后，再将器械的功能端放入玻璃珠灭菌器中进行相应时间的灭菌，从而实现对器械两端的灭菌。
5. 动物麻醉后，将其置于手术板上，背侧朝下，腹部朝上，以便使用胶带将动物前肢固定于手术板上。
6. 从颅底开始向尾侧剃除腹面毛发，并根据所记录的是哪一侧半膈肌，确保中线两侧腹部区域均被剃净。对剃毛后的皮肤表面涂抹聚维酮碘溶液。

2. CMAP记录的准备工作：

1. 完成动物准备后，将接地电极皮下植入尾部（图1）。
2. 将参考电极皮下植入对侧下腹部区域。
3. 在自粘式条状或盘状记录电极的表面涂抹导电凝胶（条状电极尺寸：0.5 × 3 cm），然后将表面电极横向置于单侧肋缘处。
4. 将刺激电极经皮植入气管外侧、锁骨上方，两电极间距0.5 cm。将电极插入皮肤约1.0 cm深度。用手固定电极，确保其位置在后续刺激过程中不发生移动。
   注意：刺激电极插入部位应与皮肤呈90°角。

3. 复合肌肉动作电位（CMAP）记录：

1. 使用刺激器/放大器获取电生理记录，随后进行计算机辅助的数据分析。
2. 单次拉刺激的刺激参数应为 0.5 毫秒、1.0 Hz 的超最大脉冲，刺激幅度应在 6.0 至 8.0 V 之间（图 2A）。
   注意： 在同一实验中，不同动物应使用相同幅度的刺激强度。目标是通过使用最小刺激幅度来最大化反应幅度。需注意，刺激瞬间出现的初始反应为刺激伪迹。此外，应确保获得的复合肌肉动作电位（CMAP）反应在刺激伪迹之后具有稳定/平坦的基线，随后迅速出现 CMAP 反应。为获得此类反应，可能需要重新调整刺激电极和/或记录电极的位置。
3. 每次刺激之间间隔 30 秒，连续重复 10 次刺激以获得平均反应（图 2B–C）。测量从基线到峰值的幅度（图 2A）。在动物呼吸周期中膈神经/膈肌未被激活的阶段进行膈神经刺激。可在同一动物上对对侧半膈肌重复该操作。
4. 在最终一次 CMAP 记录后，若需进行膈肌神经肌肉接头（NMJ）染色，则对动物进行灌注。可在同一动物上每周约进行一次（或按选定的时间间隔）重复 CMAP 记录。
5. 在存活状态下完成 CMAP 记录后，将动物置于循环温水加热垫上恢复，并在恢复期间持续监测，直至动物清醒并呈胸卧位。手术后的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
6. 动物一旦呈胸卧位，前 48 小时内每 12 小时监测一次（此后每日一次）。若动物出现脱水迹象（皮肤松弛、精神萎靡），应给予液体补充（乳酸林格氏液；皮下注射；每次 1–2 ml，注射部位轮换；每日 2 次），直至术后体重和液体流失趋于稳定。在急性术后阶段，如有必要，可在小碟中提供软化食物，以鼓励动物进食，特别是当其无法触及金属丝网盖上的饲料时。
7. 手术结束前以 0.05 mg/kg 剂量皮下注射布托啡诺，并在术后前 24 小时内每 12 小时重复一次（此后根据疼痛/应激表现决定是否继续）。若此后观察到疼痛或痛苦迹象，应继续给予布托啡诺治疗。疼痛/痛苦的迹象包括活动减少、发声、拒食或拒饮（脱水）、显著体重下降、保护性姿态、切口部位过度啃咬或搔抓。其他用于判断疼痛和痛苦的标准还包括对外界刺激无反应、短暂或无诱因的发声、呼吸费力或异常、持续的红褐色鼻眼分泌物、明显竖毛。同时应监测卫生状况不良的迹象，以提示动物健康状况不佳。若在按照上述疼痛/应激标准及前述镇痛方案治疗 72 小时后，动物仍持续表现出痛苦状态，应实施安乐死。

结果

图1：复合肌肉动作电位（CMAP）电极放置位置。接地电极皮下插入尾部。参考电极插入腹部。表面记录电极横向置于单侧肋缘处。刺激电极以红色和黑色表示。

图 2：复合肌肉动作电位（CMAP）记录与分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型弹簧剪刀	Fine Science Tools	15002-08
解剖镊	Fine Science Tools	11295-51
CMAP记录用软件	Scope 3.5.6; ADI
盘状表面电极	Natus neurology	019-409000
皮下针电极	Natus neurology	019-453100
导电凝胶	Aquasonic	122-73720
CMAP记录用刺激/记录系统	ADI Powerlab 8SP stimulator
CMAP记录用放大器	BioAMP