体内钙成像利用突触定位钙传感器在黑腹果蝇中的应用

摘要

来源：Hancock, C. E. 等., 活体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2019).

本视频演示了一种利用突触定位的钙离子传感器在果蝇中进行体内钙成像的方法。内容涵盖了为显微镜观察准备果蝇、实施嗅觉条件化训练以及可视化气味诱导的钙离子内流的各个步骤。

方案

1. 转基因果蝇，Drosophila melanogaster

1. 将携带所需 Gal4 和 UAS 构建体的雌性处女蝇与雄性果蝇（均在 25 °C、60% 相对湿度、12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下培养）进行杂交，以获得特定目标神经元表达遗传编码钙指示剂的果蝇。
2. 将上述杂交所得的雌性子代培养至羽化后 3–6 天龄。优先选用雌性果蝇，因其体型略大。

2. 果蝇活体钙成像的准备工作

1. 选取一只雌性果蝇，置于冰上麻醉，时间不超过5分钟。
2. 使用精细镊子将果蝇放入成像室中（如图1c所示）。确保其胸部和腿部与成像室底部的金属导线接触，并使头部平放。用透明胶带固定果蝇位置。
   注意：本实验方案需要使用定制的成像室，该成像室可固定果蝇，暴露头部囊以便操作，同时允许对触角施加气味刺激，并对胸部和腿部施加电击（图1）。
3. 使用安装在手术刀柄上的外科刀片（见材料表），在果蝇头部周围的胶带上切出一个窗口，保留触角被覆盖，仅暴露胸部最前端部分。
4. 使用凹凸钳夹持昆虫针，小心地将蓝光固化胶涂抹于果蝇头部的侧面和后部。使用蓝光LED灯照射固化胶水。
5. 检查胶水是否完全固化，并清除果蝇头部背侧残留的未固化胶体。
6. 滴加一滴任氏液（见材料表），覆盖暴露的头部角质层。
7. 使用极细刃的刺刀刀片切开角质层。为最有效地去除角质层，首先以单眼为起点，在头部后端横向切割；然后沿眼睛内侧向两侧上方切割，形成一个可被镊子轻松撕除的角质层瓣。
8. 移除可能遮挡目标脑区的多余角质层。
9. 使用精细镊子小心清除脑部背侧表面的任何气管组织，避免损伤脑组织本身。根据需要移除并更换任氏液（见材料表），以清除组织碎片，保持视野清洁。
10. 将皮下注射式气味递送针置于距离果蝇头部约1 cm的位置。确保无任何物体阻碍气味向触角的输送。
11. 在显微镜下，通过皮下注射式气味递送针将成像室连接至气味递送系统。
12. 为使果蝇充分从麻醉和手术中恢复，并适应气流环境，此阶段需进行10分钟的静息期。

3. 体内钙成像

1. 使用配备有红外激光器和水浸物镜的多光子显微镜（参见材料表），并将显微镜安装在防震台上。为了观察基于绿色荧光蛋白（GFP）的钙指示剂，将激光器调至920 nm的激发波长，并安装GFP带通滤光片。
2. 使用粗调Z轴旋钮，沿脑组织的Z轴方向进行扫描，定位目标脑区。利用裁剪功能，将扫描范围聚焦于该区域，以缩短扫描时间，并旋转扫描视野，使头部前方向下。
3. 将帧尺寸调整为512 × 512像素，扫描速度设为> 4 Hz，并调整扫描区域（Y方向），确保覆盖目标神经元。

4. 通过嗅觉条件化观察气味诱发的钙瞬变

1. 使用一种能够以精确时间方式递送多种气味刺激的气味递送系统。
   1. 使用一台额外的计算机来控制该设备，并与成像显微镜软件通信，以在实验过程中协调气味刺激与图像采集。
   2. 启动一个预编程的宏程序包（例如安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏程序包，参见材料表），该程序包能够将图像采集软件与气味递送程序连接，并响应由独立程序中启动气味递送协议所提供的外部输入触发信号。
2. 以 512 × 512 像素的分辨率和 4 Hz 的帧率，监测“训练前”/未经训练的气味诱发钙瞬变，开始测量。递送持续 2.5 秒的气味刺激，刺激前后分别额外采集 6.25 秒（用于建立 F₀ 基线值）和 12.5 秒的图像。依次对第二种和第三种气味分子重复此过程。
3. 在此测量结束后继续进行 3 分钟的经典条件化训练（“训练”）。
   1. 从“训练前”阶段呈现的气味中选择一种作为条件刺激（CS⁺）气味，另一种作为非条件刺激（CS^-）气味。使用计算机控制的气味递送系统递送 CS⁺ 气味 60 秒，同时施加 12 次 90 V 的电击。
   2. 在 60 秒休息后，单独呈现 CS^- 气味 60 秒。使用的气味分子为 4-甲基环己醇和 3-辛醇。在训练阶段不呈现第三种气味分子（例如 1-辛烯-3-醇），因其仅在训练前（步骤 4.2）和训练后（步骤 4.4）作为对照使用。
4. 在完成训练阶段（步骤 4.3）3 分钟后，重复执行“训练前”的气味刺激方案（步骤 4.2），再次测量“训练后”的气味诱发钙瞬变。
   注意：此步骤的时间点应反映记忆形成后感兴趣的时间（例如，在条件化刺激后 3–4 分钟执行此步骤，以研究短期记忆）。通常，果蝇在此制备条件下可存活数小时。
5. 将成像文件以适当格式（例如 Tiff）保存，用于后续图像分析。

5. 图像分析

1. 为分析图像，请在图像分析软件（如 Fiji）中打开 Tiff（或类似）文件。
2. 使用运动校正算法对图像序列进行对齐，以确保在 X 和 Y 方向上的移动最小。若记录在 Z 轴方向上出现明显移动，则应舍弃该记录。
3. 选择用于在待检测区域周围标记感兴趣区域（ROI）的软件工具。标记应尽可能精确，以减少背景荧光的影响。
4. 使用相应的软件工具从选定的 ROI 中提取时间序列的荧光强度数据，生成每个记录帧对应的数据值。
5. 使用数据分析程序打开数据，计算每条气味响应曲线的 ΔF/F₀ 值。其中 F₀ 表示气味刺激开始前 2 秒内的平均荧光强度，ΔF 表示某一帧原始荧光强度与 F₀ 的差值。根据这些数值，计算每一帧的 ΔF/F₀ 值，并将其对时间作图，以反映在整个气味刺激期间相对荧光强度的变化。

结果

图1：成像用果蝇固定装置的构建及果蝇样品的制备。（a）果蝇固定装置的构建步骤。底座由标准显微镜载玻片（1）构成，其上覆盖一层细塑料网（2）。两条带有相反电荷的导线（3）被粘附在载玻片两侧，导线去除了绝缘层并弯折后横跨载玻片（4），彼此平行但不接触。逐层添加透明胶带（5），直至达到果蝇的高度（约1 mm）。在胶带上垂直切割出一条通道（6），宽度约为1 mm，以容纳果蝇身体。在导线上方用透明胶带构建一个抬高的平台（7），作为果蝇头部的“枕头”，而胸部则位于导线上方。（b）果蝇在双光子显微镜下定位的示意图。气味刺激通过一根位于果蝇头部前方的注射针头实现（针头穿过胶带上的通道（6）并置于平台（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-辛烯-3-醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	用作气味剂的化学物质
3-辛醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	用作气味剂的化学物质
4-甲基环己醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	用作气味剂的化学物质
EGFP带通滤光片（525/50 nm）	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
透明胶带	Tesa SE, Norderstedt, Germany		标准透明胶带
凹凸钳口	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	带凹凸钳口的刀片夹持器
精细镊子	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	尖端尺寸为0.1 × 0.06 mm的镊子
皮下注射针头	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20×40 mm
昆虫用微型钉针	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	直径0.1 mm，尖端0.0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	蓝光固化胶
显微镜载玻片	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	656.1	标准载物片，76 × 26 mm
矿物油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	用作气味剂的稀释剂
锁模钛宝石激光器 Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		可调谐红外飞秒激光器
配备BiG探测器的多光子显微镜 LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		多光子显微镜，多家公司提供类似设备
Plan-Apochromat 20x（NA = 1.0）水浸物镜	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	物镜 W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
林格氏液	n.a.	n.a.	5 mM KCl、130 mM NaCl、2 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、5 mM Hepes-NaOH、36 mM 蔗糖，pH = 7.4
固定刀	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0 mm直刃，限深
外科手术刀片	Swann-Morton, Sheffield, UK	303	产品编号 11
外科手术刀柄	Swann-Morton, Sheffield, UK	907	产品编号 7S/S
Visual Basics of Applications (VBA) 软件，用于接收气味递送装置和电刺激装置（电源）的触发信号，并与控制显微镜的蔡司ZEN软件进行交互。	定制编写，可根据要求提供	n.a.	n.a.