基于微电极阵列系统的超声诱导神经调控

摘要

来源：Liang, R. 等，利用多孔微电极阵列对体外人源神经细胞进行聚焦超声神经调控。J. Vis. Exp. (2024)

本视频展示了利用聚焦超声换能器，在多孔微电极阵列（MEA）系统中对培养的人诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元进行神经元活动调控诱导的方法。

方案

1. 材料准备

1. 吸去培养基，并用其填充含有嵌入式微电极阵列（MEA）的24孔神经元培养板中的单个孔（图1A）。
2. 使用70%乙醇对Parafilm接口、橡胶圈以及带有橡胶膜的聚焦超声（FUS）探头进行10分钟的消毒处理，随后置于超净台中备用。
3. 对300 mL去离子水和50 mL耦合凝胶进行脱气处理。将水和凝胶在160 × g 条件下离心5分钟，以避免耦合介质中产生空化效应。
   注意： 人诱导性多能干细胞（HiPSCs）的原始来源为GM01582和CIPS细胞系。通常每孔可获得约5 × 10⁴个运动神经元和2.5 × 10⁴个星形胶质细胞的密度。

2. 外围设备的连接与设置

1. 使用螺丝将FUS探头固定在换能器上，并在通风的无菌操作台中用柔性橡胶膜密封探头。从步骤1.3中取脱气去离子水（DG-DI水）注入探头内部，确保探头内无气泡，以避免空化效应。
2. 使用定制的螺纹杆将3D打印的支架固定在支架框架上（图1B）。调整支架位置，使FUS换能器的头部位于待刺激孔的正上方。
3. 用橡皮筋将Parafilm封膜固定在含有培养基和HiPSCs的24孔MEA板的孔上。
4. 通过将超声换能器的后端驱动电子设备（本例中为换能器功率输出模块，TPO）连接至100-240 V电源插座，并将匹配网络连接至TPO和FUS换能器，完成FUS系统的准备工作。匹配网络可确保换能器与TPO之间的高效电耦合。
5. 将MEA系统连接至电源插座（100-240 V）（图2B，连接5）。将MEA系统的同步端口连接至TPO（图2B，连接3）。该连接将实现MEA系统数据采集与FUS刺激的同步。
6. 将24孔MEA板放入MEA系统中，并取下盖子，以确保换能器与孔板直接接触。将换能器置于孔板上方5-10 mm处，为后续步骤3.2所述的脱气耦合凝胶预留空间（图2A和图1B）。

3. 刺激与神经信号采集

1. 在TPO控制面板上设置FUS参数（表1）。
2. 在Parafilm顶部涂抹耦合凝胶，并将FUS换能器浸入耦合凝胶中，确保与凝胶充分接触且气泡最少（图1A）。
3. 在用户界面中点击开始按钮，启动MEA系统记录。
4. 按下TPO右下角的按钮（图2A，标签7）开始FUS超声处理，每次超声处理之间至少等待5分钟，以使神经元恢复至基线状态。
5. 利用FUS系统生成的触发脉冲，将FUS刺激序列与MEA记录对齐（图1B，连接3）。

表1：在TPO上设定的聚焦超声（FUS）参数

参数	数值
最大功率/通道	1.200 W
Pactual	0.749 W/通道
ISPPA	10.79 W/cm2
ISPTA	0.05 W/cm2
脉冲持续时间	0.100 ms
频率	250.00 kHz
焦点	39.800 mm
周期	20.000 ms
定时器	60.000 s

结果

图1：使用多孔微电极阵列（MEA）进行聚焦超声（FUS）神经调控。 (A) 使用多孔MEA进行FUS神经调控的实验装置示意图。FUS换能器产生的声波穿过充满脱气水的FUS锥体，并通过超声耦合凝胶实现声学耦合。使用橡皮筋将帕拉膜（parafilm）固定在孔上，以防止污染。MEA板将来自神经元的电信号记录传输至MEA系统。(B) 置于MEA系统内的多孔板上的FUS换能器实物照片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MEA 系统	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	采样率：11500 Hz
MEA 培养板	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	电极与孔：24 孔中含 16 个电极
培养板接口	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	厚度：127 µm
细胞培养用 CO₂ 气瓶及减压阀	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	浓度：5%
培养基	ThermoFisher Inc.	Laminin；23017-015	浓度：1 µg/mL
人诱导多能干细胞来源神经元（HiPSC 神经元）	Peprotech	CIPS 和 GM01582 来源；450-10	浓度：10 ng/mL（参见 Taga 等 [2021]¹³）
换能器	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	中心频率：250 kHz
匹配网络	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	阻抗：50 Ω
换能器输出功率（TPO）	Sonic Concepts Inc.	版本 4.1；020	频率：250 kHz 至 2.5 MHz
膜材料	McMaster Inc.	硅橡胶；5542N115	厚度：0.0127 cm
耦合凝胶	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100；B08DDWG GXB	黏度：130,000–185,000 cops
探头支架连接件	McMaster Inc.	不锈钢螺纹杆；90322A661	长度：1–1/2" 长
水听器	Sonic Concepts Inc.	Y-104；009	频率范围：50 kHz–1.9 MHz
水箱	Sonic Concepts Inc.	WT	尺寸：30 cm × 30 cm × 30 cm
水温调节装置	Sonic Concepts Inc.	WCU；SN006	最大流速：50 mL/s
示波器	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	采样率：最高 50 MHz
位移平台	Sonic Concepts Inc.	MicroStage；2	精度：1 µm
热致变色片	TIPTEMP Inc.	液晶片；TLCSEN337	响应范围：22–24 °C
计算机	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4：3.7 GHz
数据传输软件	Mathworks Inc.	MATLAB	版本 2021b
数据处理软件	Python Software Foundation	Python	版本 3.7.10