光遗传电生理记录具有光依赖性离子通道的细胞

摘要

来源：Grimm, C., 等. 利用全细胞膜片钳记录技术通过电生理方法测定通道视紫红质的离子选择性. 视觉化实验杂志 (2017)

在本视频中，表达与荧光报告蛋白融合的光依赖性离子通道蛋白的胚胎肾细胞培养物展示了光对离子移动的影响。采用全细胞膜片钳技术来监测离子的移动。

方案

1. 录制前的准备工作

1. 根据表1所示的离子浓度配制记录溶液。​
   1. 在超纯水中配制 15 mL 的 2 M MgCl 储存液₂，CaCl₂KCl 和 CsCl。
   2. 根据表1，将细胞内液（100 mL）和细胞外液（500 mL）缓冲溶液的固体成分分别称量至不同的烧杯中，随后加入相应体积的预先配制的母液。例如，配制细胞内液缓冲液时，加入0.3803 g（10 mM）EGTA（乙二醇四乙酸）、0.2383 g（10 mM）HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）和0.6428 g（110 mM）NaCl，并加入100 µL的2 M MgCl₂母液。₂ 和 CaCl₂ 以及50 µL的2 M KCl和CsCl储备液。
   3. 加入超纯水，并使用不会干扰测量的酸和碱小心调节pH值。 即 不由ChR（通道视紫红质）介导，例如柠檬酸和N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG+）。
   4. 使用葡萄糖将细胞内液的渗透压调节至290 mOsm，将细胞外液的渗透压调节至320 mOsm。
      注意： 轻度低渗的细胞内溶液可提高膜片钳制的成功率。
   5. 所有溶液均需通过0.22 µm滤膜进行无菌过滤。溶液可在4 °C保存....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293细胞	Sigma Aldrich	85120602	人胚胎肾细胞
视黄醛	Sigma Aldrich	R2500	全反式视黄醛
FuGENE HD	Promega	E2312	转染试剂
DMEM	Biochrome	FG 0445	杜尔贝科改良伊格尔培养基
琼脂糖	Roth	3810	琼脂桥
CaCl2	Roth	5239	CaCl2·2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	细胞培养
葡萄糖	Roth	HN06	D(+)-葡萄糖
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2·6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-甲基-D-葡糖胺
Na-天冬氨酸	Sigma Aldrich	A6683	L-天冬氨酸钠盐一水合物
柠檬酸	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	限制性内切酶
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	限制性内切酶
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	限制性内切酶
XL1Blue E.coli/	Agilent Technologies	200249	化学感受态E.coli
卡那霉素	Roth	T832
LB培养基	Roth	X964
琼脂粉	Roth	6494	琼脂平板
质粒纯化试剂盒	Marchery-Nagel	740727.25
青霉素/链霉素	Biochrome	A 2213	细胞培养
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407-5MG	盖玻片包被
微电极拉制仪	定制		火焰抛光
血清移液管	TPP		不同规格
超净工作台	Kojair	Biowizard SL130
搅拌器	IKA	RCT classic
银丝	Science Products	AG-T25; AG-T10	电极，0.64 mm（浴槽）；0.25 mm（电极）
pH计	Knick	765 Calimetric
渗透压计	Vogel	OM 815
显微镜	Carl Zeiss	ID03	火焰抛光
CO2培养箱	Binder	CB150
细胞培养皿	TPP	93040	内径34 mm
盖玻片	Roth	P232	直径15 mm
温度计	Rössel Messtechnik	MTM12
分光镜	Chroma	21011	90/10透射
移液器支架	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
前置放大器	Molecular Devices	CV203BU
放大器	Molecular Devices	AxoPatch200B
模数转换器	Molecular Devices	DigiData1400	数字模拟转换器
光源	TILL Photonics	Polychrome V	设定为540 nm全强度
显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 100
快门	Vincent Associates	VS25
快门驱动器	Vincent Associates	VCM-D1
玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	硼硅酸盐毛细管，末端火焰抛光，外径1.5 mm，内径 0.86 mm
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P1000
灌流系统	Lorenz Messgerätebau	MPCU
三通道滤光片组	Chroma	69008	荧光滤光片  ECFP/EYFP/mCherry
CCD相机	Watec	Wat-221SCCD
光度计	Gigahertz Optik	P9710	测量光强
物镜	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
显微操作器	Scientifica	PatchStar
记录室	定制
电源	Manson	HCS-3202	避免显微镜内置电源产生的电噪声
防震台	Newport	M-VW-3636-OPT-01
法拉第笼	定制或任何匹配的商用产品
管路	任意商用；例如Roth		不同尺寸和材质，用于灌流系统和微电极加压；琼脂桥
线性摇床	Sunlab Instruments	SU 1000
液接电位计算器	Molecular Devices或直接联系Peter H. Barry		该程序包含在Clampex采集软件中，或可从 p.barry@unsw.edu.au获取
数据采集软件	Molecular Devices	Clampex 10.X
数据分析软件	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank或Addgene	KF992074.1或Addgene质粒#85465	编码PsACR1的基因
放大器使用指南	Molecular Devices	The Axon Guide