光遗传电生理记录具有光依赖性离子通道的细胞

摘要

来源：Grimm, C., 等. 利用全细胞膜片钳记录技术通过电生理方法测定通道视紫红质的离子选择性. 视觉化实验杂志 (2017)

在本视频中，表达与荧光报告蛋白融合的光依赖性离子通道蛋白的胚胎肾细胞培养物展示了光对离子移动的影响。采用全细胞膜片钳技术来监测离子的移动。

方案

1. 录制前的准备工作

1. 根据表1所示的离子浓度配制记录溶液。​
   1. 在超纯水中配制 15 mL 的 2 M MgCl 储存液₂，CaCl₂KCl 和 CsCl。
   2. 根据表1，将细胞内液（100 mL）和细胞外液（500 mL）缓冲溶液的固体成分分别称量至不同的烧杯中，随后加入相应体积的预先配制的母液。例如，配制细胞内液缓冲液时，加入0.3803 g（10 mM）EGTA（乙二醇四乙酸）、0.2383 g（10 mM）HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）和0.6428 g（110 mM）NaCl，并加入100 µL的2 M MgCl₂母液。₂ 和 CaCl₂ 以及50 µL的2 M KCl和CsCl储备液。
   3. 加入超纯水，并使用不会干扰测量的酸和碱小心调节pH值。 即 不由ChR（通道视紫红质）介导，例如柠檬酸和N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG+）。
   4. 使用葡萄糖将细胞内液的渗透压调节至290 mOsm，将细胞外液的渗透压调节至320 mOsm。
      注意： 轻度低渗的细胞内溶液可提高膜片钳制的成功率。
   5. 所有溶液均需通过0.22 µm滤膜进行无菌过滤。溶液可在4 °C保存两周，或于-20 °C冷冻长期保存。
2. 计算液接电位并准备记录程序。
   注意： 建立全细胞记录构型后，细胞外氯离子浓度的改变会引起显著的液接电位（LJP），必须进行校正。液接电位可通过直接测量或计算获得，本文采用后者。本方案中将使用在线校正，因此每种细胞外液均需对应一个记录方案。然而，当涉及较多细胞外溶液时，建议采用事后校正以避免错误校正。
   1. 打开液接电位计算器（JPC），点击“新建实验”对话框。然后选择“膜片钳测量”，接着选择“全细胞测量”和“标准盐溶液电极”，并输入温度为 25 °C。每完成一步后，点击“下一步”按钮确认选择，进入下一阶段。
      ​注意： 实验在空调实验室中于25 °C室温下进行。实验开始前，确保缓冲液处于室温。如需调节样品温度，可使用孵育台或孵育室。浴槽温度可频繁使用温度计测量。
   2. 根据所列浓度，将移液溶液和高氯酸盐缓冲液中所有单独的阴离子和阳离子浓度相加 表1.
      注意： JPC 将根据起始条件计算出 -0.5 mV 的液接电位（LJP）。
   3. 点击“新建缓冲液”以输入低氯缓冲液的阴离子和阳离子组成。
      注意： JPC 现在将根据改变的细胞外记录液计算出一个新的液接电位（LJP）为 +12.6 mV。
   4. 通过从施加的钳制电位中减去计算得到的液接电位（LJP），为两种测量条件分别准备两个已校正LJP的实验方案：高氯外部溶液校正值为-0.5 mV，低氯外部溶液为+12.6 mV。因此，两种方案的起始钳制电位分别为-79.5 mV（高氯）和-92.6 mV（低氯），以使两种情况下LJP校正后的起始钳制电位均为-80 mV。
      注意： 以下步骤适用于材料清单中提到的数据采集软件。
   5. 在采集软件中打开协议编辑器。从“模式”菜单中选择“ episodic stimulation”（ episodic 刺激），并包含 7 次扫描。
   6. 在编辑器中切换至“波形”菜单，设置一段持续 200 ms、保持电位为 0 mV 的时期，随后设置一段持续 2 s、起始保持电位于 -79.5 mV（高氯条件）并逐步变化的时期。为第二段时期设置“增量电平”为 20 mV，使每次扫描的保持电位递增 20 mV。
   7. 在波形编辑器的电压步进期间，施加540 nm光（3.10 mW/mm²）照射，持续500 ms。具体操作为：更改连接快门的“数字位模式”，使其在上述第二个时段开始后500 ms启动，以控制光源开启。
      注意： 光强度可影响通道电流的生物物理特性，如电流幅度或失活程度。因此，应始终报告光功率密度。为测量光束经所有光学元件和盖玻片后的光功率，需使用经校准的光度计。为计算光功率密度，应使用物镜测微尺确定物镜下被照明的视野面积，再将测得的光功率除以该照明面积。
   8. 保存高氯化物细胞外溶液的实验方案。修改该方案，将第一级钳制电位替换为 -92.6 mV（低细胞外氯化物条件）。保存此第二个方案，用于测量低氯化物细胞外环境。
3. 根据改进方案对玻璃盖玻片进行赖氨酸包被。​
   1. 将多个100张盖玻片放入玻璃培养皿中，加入250 mL盐酸（1 N）。
   2. 将带有盖玻片的培养皿置于线性摇床上，以120 rpm振荡72小时以清洁盖玻片，随后用超纯水冲洗以中和pH值。
   3. 用少量95%乙醇浸泡以进一步清洁。
      注意：清洁的盖玻片可在进行后续操作前保存在70%乙醇中。以下步骤需在层流罩内操作。
   4. 使用本生灯和镊子将每张盖玻片灼烧灭菌，然后转移至新的培养皿中。
   5. 将玻璃盖玻片与无菌的50 µg/mL多聚-D-赖氨酸溶液在室温下于线性摇床以150 rpm振荡孵育至少1小时（或过夜）。
   6. 用超纯水清洗盖玻片，以去除多余的聚-D-赖氨酸。
   7. 将盖玻片平铺于无菌纸上干燥10分钟，并用紫外线（UV）照射至少20分钟以进行消毒。
   8. 将盖玻片收集至一个用铝箔覆盖的无菌培养皿中，待用。
4. 准备DNA的 Ps使用标准分子生物学技术将 ACR1 基因与 mCherry 融合。​
   1. 克隆编码人源密码子优化基因的序列 Ps将ACR1通过限制性内切酶或其他成熟的克隆方法，定向插入含有mCherry荧光蛋白的peGFP-C1质粒（CMV（巨细胞病毒）启动子，卡那霉素抗性）中，确保读码框正确。
      注意：也可使用其他荧光染料，但需确保实验装置中备有相应的滤光片组，以便在显微镜下观察其荧光信号。
   2. 将质粒DNA转化至化学感受态XL1Blue中 大肠杆菌 按照标准方案通过热激转化细胞，并涂布于含卡那霉素（30 µg/mL）的琼脂平板上。将平板上的细菌在37 °C过夜培养。
   3. 第二天，从单菌落中挑取细胞接种于4 mL含有30 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 °C、180 rpm条件下在摇床中过夜培养。
   4. 过夜培养后，使用 commercially available kit 按照生产商说明书从菌液中纯化质粒 DNA。
5. 接种细胞
   注意： 在超净工作台内进行以下步骤。
   1. 在35 mm培养皿中并排放置最多三片经赖氨酸包被的玻璃盖玻片。
      注意： 轻轻按压它们，使其紧贴培养皿底部，以防止相互滑动。
   2. 接种 1.5 × 10⁵ 在每个培养皿中加入2 mL标准DMEM（杜氏改良伊格尔培养基），并添加10%胎牛血清（FBS），用于培养HEK（人胚胎肾细胞）。
   3. 补充全部-转 以终浓度1 µM的视黄醛处理细胞，继续培养至少一天后，进行步骤1.6。
6. 通过脂质体转染法瞬时转染细胞。
   1. 为每皿细胞，配制含有2 µg质粒DNA（脱氧核糖核酸）、250 µL不含FBS的DMEM培养基和6 µL转染试剂的溶液。
   2. 孵育15分钟后，将溶液轻轻逐滴加入细胞中。
7. 制备琼脂盐桥
   1. 将0.75 g琼脂糖加入50 mL无菌氯化钠溶液（140 mM）中，通过微波加热溶解。
      注意： 用于制备琼脂桥的 2 - 3 M KCl 因浓度更高，可进一步降低液接电位（LJP）例如 恒定的桥接扩散以及 K⁺ 和 Cl⁻ 离子的迁移率相等，但为尽量减少离子（尤其是 Cl⁻）向浴液中的泄漏而避免使用。
   2. 使用注射器将液体琼脂糖溶液吸入10 µL吸头（或小直径软管）中。
      注意： 避免桥接中产生气泡。
   3. 琼脂桥冷却凝固后，将其储存在无菌的 140 mM 氯化钠溶液中。
8. 准备记录电极和浴电极。​
   1. 从膜片钳装置的浴液和记录电极中取出银丝。
   2. 用砂纸打磨金属丝，以去除先前实验残留的氯化银。将洁净的银丝浸入3 M KCl溶液中，连接至1.5 V电池的正极，进行氯化银的电解镀覆。
      ​注意： 可以使用实验室电源代替电池。
9. 使用微电极拉制仪从玻璃毛细管中拉制低阻值膜片钳电极（1.5–3.0 MΩ），并进行焰熔抛光。将电极置于无尘环境中保存，待测量当日使用。
10. 在记录前30分钟打开所有装置组件，使其升温至工作温度。确保缓冲液处于室温。

2. 选择性测量

1. 在细胞瞬时转染后的24至48小时开始记录。
2. 将一张盖玻片放入测量室中，并用硅胶密封以防止外部缓冲液泄漏。将装有其余盖玻片的培养皿置于孵育箱中，用于下一轮实验。
3. 用细胞外缓冲液（高[Cl⁻]）小心填充腔室，以防止细胞脱落，然后将腔室置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。
4. 将琼脂桥置于浴电极上方，并与液面传感器及灌流出口一同放入记录室。
5. 用1 mL新鲜的外部溶液（高[Cl⁻]）更换细胞外溶液两次，以去除残留的培养基和脱落的细胞。
6. 将细胞调至清晰对焦，寻找已转染（带荧光）的细胞，并确保该细胞与其他细胞分离。使用三通道滤光片组和橙色光（590 nm；带宽15 nm；100% 强度）激发并观察 mCherry。
   注意： HEK细胞可通过间隙连接与邻近细胞形成电耦合，导致全细胞构型下膜电阻较低。
7. 用细胞内液填充一支拉制好的移液管，并通过多次翻转移液管以去除气泡。
8. 将移液器安装在移液器架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。
9. 在显微镜下找到膜片钳电极尖端，并使用显微操作器将其移至细胞附近。
   注意： 以下步骤适用于材料清单中提到的放大器、数据采集和评估软件。
10. 在数据采集软件中启动“膜测试”，并施加一个电压阶跃（测试脉冲； 例如 5 mV，持续10 ms，基线为0 mV），可通过指定软件手动或自动完成，操作时在数据采集软件中运行“膜测试”并使用“浴槽模式”。
11. 检查移液管电阻是否在理想范围内（1.5–3.0 MΩ）。
12. 通过在“膜测试”的“浴液模式”下调节放大器上的移液电极偏移旋钮，调整移液电极电位以校正零偏移电流。
13. 建立全细胞膜片钳构型。
    注意： 以下步骤需要向所用移液器 holder 的侧端口施加正压和负压。可通过注射器、吹管或电子控制的压力调节器来实现。本方案中采用正压和负压 通过 一个吹嘴。
    1. 从上方缓慢将膜片电极移向细胞，并在即将接触细胞时解除正压。
       ​注意： 当移液管尖端接近细胞时，电阻会略有上升；这表现为测试脉冲的幅度减小。
    2. 将“膜测试”从“浴槽模式”更改为“膜片模式”，从而使细胞的保持电位达到预期的静息电位（-30 至 -40 mV）。
    3. 在某些情况下，细胞贴附式构型在释放正压后会自行形成。若未形成，可轻轻施加负压以促进吉欧封接的形成。
       注意： 当测试脉冲减小为脉冲起始和结束时的两个微小电容峰，且膜电阻达到吉欧姆（GΩ）范围时，即形成细胞贴附式构型；施加最高至-60 mV的负电压可能有助于吉欧姆封接的形成。
    4. 通过调节“移液管电容补偿”旋钮，使测试脉冲的响应呈平坦状态，以补偿移液管电容。
    5. 通过施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，使膜片破裂但不破坏封接，以获得全细胞构型。
       注意： 细胞贴附式成功转变为全细胞构型的标志是电容峰的增大。
    6. 通过设置所用放大器的全细胞参数和补偿调节，应用串联电阻补偿，以准确将膜电位钳制在目标钳制电压。
       1. 将“膜测试”切换至“全细胞”模式，在“串联电阻补偿”面板中开启“预测”和“校正”功能，最高可达90%，避免电容性反应出现超调和振荡；打开全细胞补偿开关，并通过放大器前面板上的相应旋钮（“全细胞电容”和“串联电阻”）以迭代方式调节全细胞参数，以获得理想平坦的测试封接反应。
          注意： 有关串联电阻补偿与校正的详细描述，请参阅放大器使用手册或操作指南，因为不同制造商的该操作流程可能有所不同。
    7. 建立全细胞记录模式后，需等待至少2分钟再开始记录，以确保通过膜片钳电极充分置换细胞内液。
14. 使用先前建立的方案（1.2 中设置）在不同钳制电位下记录光诱导电流。
15. 在不破坏膜片的情况下，用低[Cl-]细胞外液至少置换灌流 chamber 中的细胞外液五次，并记录另一条电流-电压关系曲线。参见 步骤1.2）在新的氯化物浓度下。
    注意： 自动化缓冲液置换灌注系统有助于此过程，但并非必需。
16. 针对每种待测的离子条件，重复步骤 2.15，但在各次测量之间需反复通过上述“膜测试”检查封接质量。
    注意： 为确保膜电位准确且细胞内离子成分稳定，膜电阻应高于 500 MΩ，而接入电阻不得超过 10 MΩ，参见. 2.12.6）进行膜电容测试时，切记关闭全细胞参数补偿。
17. 重复步骤 2.2 至 2.15，对多个细胞进行操作，但每次测试系列需使用新的盖玻片，以确保细胞的健康状态。

表1：缓冲溶液的离子组成。 HEK细胞中氯离子选择性实验所用的细胞内（内液）和细胞外（外液）缓冲液的组成。所用缩写：乙二醇四乙酸（EGTA）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和天冬氨酸（ASP）。所有浓度单位均为 mM。

	细胞内	细胞外1	细胞外2
	高氯	低氯	低氯
	c [mM]	c [mM]	c [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	2	2	2
MgCl2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
pH	7.2	7.2	7.2
渗透压	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293细胞	Sigma Aldrich	85120602	人胚胎肾细胞
视黄醛	Sigma Aldrich	R2500	全反式视黄醛
FuGENE HD	Promega	E2312	转染试剂
DMEM	Biochrome	FG 0445	杜尔贝科改良伊格尔培养基
琼脂糖	Roth	3810	琼脂桥
CaCl2	Roth	5239	CaCl2·2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	细胞培养
葡萄糖	Roth	HN06	D(+)-葡萄糖
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2·6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-甲基-D-葡糖胺
Na-天冬氨酸	Sigma Aldrich	A6683	L-天冬氨酸钠盐一水合物
柠檬酸	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	限制性内切酶
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	限制性内切酶
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	限制性内切酶
XL1Blue E.coli/	Agilent Technologies	200249	化学感受态E.coli
卡那霉素	Roth	T832
LB培养基	Roth	X964
琼脂粉	Roth	6494	琼脂平板
质粒纯化试剂盒	Marchery-Nagel	740727.25
青霉素/链霉素	Biochrome	A 2213	细胞培养
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407-5MG	盖玻片包被
微电极拉制仪	定制		火焰抛光
血清移液管	TPP		不同规格
超净工作台	Kojair	Biowizard SL130
搅拌器	IKA	RCT classic
银丝	Science Products	AG-T25; AG-T10	电极，0.64 mm（浴槽）；0.25 mm（电极）
pH计	Knick	765 Calimetric
渗透压计	Vogel	OM 815
显微镜	Carl Zeiss	ID03	火焰抛光
CO2培养箱	Binder	CB150
细胞培养皿	TPP	93040	内径34 mm
盖玻片	Roth	P232	直径15 mm
温度计	Rössel Messtechnik	MTM12
分光镜	Chroma	21011	90/10透射
移液器支架	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
前置放大器	Molecular Devices	CV203BU
放大器	Molecular Devices	AxoPatch200B
模数转换器	Molecular Devices	DigiData1400	数字模拟转换器
光源	TILL Photonics	Polychrome V	设定为540 nm全强度
显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 100
快门	Vincent Associates	VS25
快门驱动器	Vincent Associates	VCM-D1
玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	硼硅酸盐毛细管，末端火焰抛光，外径1.5 mm，内径 0.86 mm
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P1000
灌流系统	Lorenz Messgerätebau	MPCU
三通道滤光片组	Chroma	69008	荧光滤光片  ECFP/EYFP/mCherry
CCD相机	Watec	Wat-221SCCD
光度计	Gigahertz Optik	P9710	测量光强
物镜	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
显微操作器	Scientifica	PatchStar
记录室	定制
电源	Manson	HCS-3202	避免显微镜内置电源产生的电噪声
防震台	Newport	M-VW-3636-OPT-01
法拉第笼	定制或任何匹配的商用产品
管路	任意商用；例如Roth		不同尺寸和材质，用于灌流系统和微电极加压；琼脂桥
线性摇床	Sunlab Instruments	SU 1000
液接电位计算器	Molecular Devices或直接联系Peter H. Barry		该程序包含在Clampex采集软件中，或可从 p.barry@unsw.edu.au获取
数据采集软件	Molecular Devices	Clampex 10.X
数据分析软件	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank或Addgene	KF992074.1或Addgene质粒#85465	编码PsACR1的基因
放大器使用指南	Molecular Devices	The Axon Guide