内耳感觉神经元胞体的穿孔膜片钳记录

摘要

来源：Iyer, M. R., 等. 从新生啮齿类动物分离并培养前庭和螺旋神经节胞体用于膜片钳记录。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频演示了用于测量内耳感觉神经元胞体中离子电流的膜片钳技术。详细介绍了制备和使用经抛光的膜片钳移液管的方法，该移液管内充满含有两性霉素B的内液，可穿透细胞膜以允许离子移动，同时保持细胞内环境的稳定。通过施加电压脉冲来触发并记录离子通道的活动，从而深入了解其特性与行为。

方案

1. 记录

注意：在本实验中，通常在接种后 12–24 小时对分离的神经节进行膜片钳记录。其他实验室已报道了培养更长时间后的神经元实验结果。

1. 准备记录室
   1. 使用快速交换记录室（或等效装置），该装置可直接在培养皿中进行膜片钳记录。将记录室安装在倒置显微镜上。
   2. 将玻璃底培养皿插入记录室中。
   3. 通过灌流管路系统将L-15溶液输送至记录室。调节灌流速度，使记录室内的流入和流出速率稳定在每分钟0.5–1 mL。
2. 准备电极填充用内液
   1. 解冻一份穿孔膜片钳内液。取2.5 mL该溶液加入一个35 mm培养皿中。盖上培养皿盖子并标记为“尖端浸入液”。将其置于无尘区域备用，保持溶液尽可能洁净至关重要。
   2. 称取1 mg两性霉素B，加入20 µL二甲基亚砜（DMSO）。涡旋混匀并短暂离心，直至两性霉素B完全溶解。取10 µL DMSO/两性霉素B溶液加入剩余的2 mL解冻后的穿孔膜片钳内液中。用移液器反复吹吸2–3次，确保DMSO/两性霉素B均匀混合于内液中。溶液将呈现轻微的淡黄色。
   3. 将含两性霉素B的穿孔膜片钳内液吸入一支3 mL注射器中。在注射器前端接上34 G针头。用铝箔包裹注射器，并将其置于冰上保存。
      注意：为确保两性霉素B穿孔细胞膜的有效性，该溶液必须每隔2小时重新配制一次。两性霉素B对光敏感，必须使用铝箔或其他方法避光保存。
3. 膜片钳记录
   1. 使用10x或20x物镜观察神经元。调节照明并优化光学系统，以清晰看到细胞周围的边界和阴影。
   2. 检查分离神经元的质量。仅选择表面光滑、对比度适中、仅有少量分散小凹坑的神经元进行记录。同时应避免成对的神经元、周围有碎片或其他细胞的神经元。
   3. 在100倍放大倍数下，选定一个待记录的神经元或神经元区域，并将其置于视野中央。
   4. 将移液管尖端浸入培养皿中的洁净溶液（不含两性霉素B）约20秒，使毛细作用将少量溶液吸入尖端。
      注意：此步骤应在体视解剖显微镜下进行，以便观察尖端对“尖端浸入液”的保持情况。若溶液无法保持约10–20秒，则表明电极形状不理想。此时应调整电极拉制程序，以获得更长的尖端。
   5. 随后，将含两性霉素B的内液从移液管后端注入。移液管内的细丝结构会将溶液向下牵引，直至与尖端的洁净溶液相遇。让细丝自然地将溶液拉下，切勿敲击以排除气泡，否则会导致两性霉素B过快进入尖端。
   6. 使用注射器抽出可能残留在电极后端的液体。
      注意：从此时起必须迅速操作，尽快将电极定位并形成高阻封接。
   7. 将移液管插入移液管夹持器中。检查移液管是否牢固固定，以防漂移。若移液管不稳定，应更换夹持器前后端的密封O型圈，以减少漂移并维持良好负压。必要时更换新填充的移液管。
   8. 将移液管下放至记录室的浴液中。
   9. 将移液管尖端定位在视野中央，确保尖端无气泡或其他杂质。
   10. 在膜测试中施加一个电压阶跃（5 mV），以监测移液管电阻。在整个细胞封接形成过程中持续监测输入电阻。
   11. 取消移液管偏置电位，使pClamp系统的膜测试模式下移液管电流读数为零。
   12. 使用膜片钳放大器上的快速电容补偿功能（Multiclamp Commander软件面板中的Cp fast旋钮）校正移液管电容。
   13. 将移液管下移靠近细胞。
   14. 当移液管接近神经元时，切换至更高倍率的物镜，并通过相机将图像传至显示器（使用40x物镜，总放大倍数为400x）。调整移液管位置，重新将神经元置于视野中心。
   15. 将记录电极移近胞体。在显示器上确定神经元中心位置，并将记录电极置于神经元正上方。
   16. 从上方接近神经元，使电极落在球形细胞的中心位置。调整移液管偏置，以消除系统中的恒定直流电位。
   17. 将移液管靠近细胞膜，并牢固地落在细胞中心。
       注意：落点时，神经元表面会出现轻微凹陷，同时输入电阻会升高至原来的两到三倍。
   18. 使用注射器或口吸管施加负压（抽吸）。开启-60 mV的保持电位。封接电阻应逐渐上升并超过千兆欧（giga-ohm）。
       注意：应尽快操作，以缩短电极填充至落点于细胞之间的时间。在穿孔膜片钳内液中的两性霉素B到达电极尖端前，操作时间有限。一旦尖端被两性霉素B污染，将难以形成高阻封接，电阻通常仅能达到约200兆欧。
   19. 当形成千兆欧级封接后，释放负压。封接一旦形成，立即进行快速电容补偿，尽可能降低膜测试模式下移液管电容瞬变的幅度。
   20. 随着两性霉素B开始发挥作用，观察输入电阻缓慢下降，同时响应5 mV电压阶跃的电流逐渐增大。若串联电阻突然下降而非逐步稳定，则提示发生了自发性破裂。
   21. 使用放大器的电容瞬变调零功能估算全细胞电容和串联电阻。在实验开始时及实验过程中定期记录并监测串联电阻。
       注意：串联电阻的稳定时间通常为5–20分钟，具体取决于电极尺寸以及吸入移液管的洁净溶液量。当串联电阻稳定在30兆欧以下时，方可使用电压钳和电流钳模式。记录过程中有时会观察到神经元肿胀或收缩，但在溶液渗透压和pH值正确调节的情况下较为罕见。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	用于穿孔膜片钳记录。
ATP 二钠	Sigma-Aldrich	A7699	内液添加剂
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	内液添加剂
DMSO	Biotium	90082
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	内液添加剂
电极拉制仪	Narashige	PC-10
乙醇	Decon Labs	2716	用于清洁头部及解剖台周围区域
用于电极的带丝硼硅酸盐毛细管	Sutter Instruments	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	用于本方案中所有溶液的pH缓冲
加热板/磁力搅拌器	VWR	76549-914
K2SO4，硫酸钾	Sigma Aldrich	P9458-250G	内液添加剂
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	内液添加剂
KOH（1 M）	霍尼韦尔	319376-500ML	调节内液至所需 pH 值。
用于培养皿的低剖面浴式记录室	Warner Instruments	64-0236
MgCl2六水合物	Sigma-Aldrich	M1028	内液添加剂
用于填充微移液管的 microFil 针头 - 34 号	World Precision Instruments	MF34G
显微操作仪	Narashige	MF-90	用于电极抛光。
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	内液添加剂
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	用于滴定 pH
医用级氧气，配备适当的调节器和导管	南加州大学物资管理	MEDOX200（编号：00015）	用于溶解于解剖液和灌流液中
聚-D-赖氨酸包被的玻璃底 培养皿	Mattek	P35GC-0-10-C	用于神经元培养的铺板
PES 膜滤器，0.2 微米	Nalgene	566-0020	用于过滤溶液
PES膜无菌注射器滤器，0.22 μm，30 mm	CELLTREAT	229747	用于过滤吸入注射器的溶液
pH计	Mettler Toledo	Model S20
参照细胞	世界精密仪器公司	RC1T
科学天平	Mettler Toledo	XS64
1000毫升容量瓶
水，无菌超纯，R>18.18 兆欧·厘米（例如，经 Millipore-Sigma 水纯化系统过滤）	Millipore-Sigma	CDUFBI001