内耳感觉神经元胞体的穿孔膜片钳记录

摘要

来源：Iyer, M. R., 等. 从新生啮齿类动物分离并培养前庭和螺旋神经节胞体用于膜片钳记录。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频演示了用于测量内耳感觉神经元胞体中离子电流的膜片钳技术。详细介绍了制备和使用经抛光的膜片钳移液管的方法，该移液管内充满含有两性霉素B的内液，可穿透细胞膜以允许离子移动，同时保持细胞内环境的稳定。通过施加电压脉冲来触发并记录离子通道的活动，从而深入了解其特性与行为。

方案

1. 记录

注意：在本实验中，通常在接种后 12–24 小时对分离的神经节进行膜片钳记录。其他实验室已报道了培养更长时间后的神经元实验结果。

1. 准备记录室
   1. 使用快速交换记录室（或等效装置），该装置可直接在培养皿中进行膜片钳记录。将记录室安装在倒置显微镜上。
   2. 将玻璃底培养皿插入记录室中。
   3. 通过灌流管路系统将L-15溶液输送至记录室。调节灌流速度，使记录室内的流入和流出速率稳定在每分钟0.5–1 mL。
2. 准备电极填充用内液
   1. 解冻一份穿孔膜片钳内液。取2.5 mL该溶液加入一个35 mm培养皿中。盖上培养皿盖子并标记为“尖端浸入液”。将其置于无尘区域备用，保持溶液尽可能洁净至关重要。
   2. 称取1 mg两性霉素B，加入20 µL二甲基亚砜（DMSO）。涡旋混匀并短暂离心，直至两性霉素B完全溶解。取10 µL DMSO/两性霉素B溶液加入剩余的2 mL解冻后的穿孔膜片钳内液中。用移液器反复吹吸2–3次，确保DMSO/两性霉素B均匀混合于内液中。溶液将呈现轻微的淡黄色。
   3. 将含两性霉素B的穿孔膜片钳内液吸入一支3 mL注射器中。在注射器前端接上34 G针头。用铝箔包裹注射器，并将其置于冰上保存。
      

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	用于穿孔膜片钳记录。
ATP 二钠	Sigma-Aldrich	A7699	内液添加剂
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	内液添加剂
DMSO	Biotium	90082
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	内液添加剂
电极拉制仪	Narashige	PC-10
乙醇	Decon Labs	2716	用于清洁头部及解剖台周围区域
用于电极的带丝硼硅酸盐毛细管	Sutter Instruments	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	用于本方案中所有溶液的pH缓冲
加热板/磁力搅拌器	VWR	76549-914
K2SO4，硫酸钾	Sigma Aldrich	P9458-250G	内液添加剂
KCl	Sigma-Aldrich	P93333	内液添加剂
KOH（1 M）	霍尼韦尔	319376-500ML	调节内液至所需 pH 值。
用于培养皿的低剖面浴式记录室	Warner Instruments	64-0236
MgCl2六水合物	Sigma-Aldrich	M1028	内液添加剂
用于填充微移液管的 microFil 针头 - 34 号	World Precision Instruments	MF34G
显微操作仪	Narashige	MF-90	用于电极抛光。
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	内液添加剂
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	用于滴定 pH
医用级氧气，配备适当的调节器和导管	南加州大学物资管理	MEDOX200（编号：00015）	用于溶解于解剖液和灌流液中
聚-D-赖氨酸包被的玻璃底 培养皿	Mattek	P35GC-0-10-C	用于神经元培养的铺板
PES 膜滤器，0.2 微米	Nalgene	566-0020	用于过滤溶液
PES膜无菌注射器滤器，0.22 μm，30 mm	CELLTREAT	229747	用于过滤吸入注射器的溶液
pH计	Mettler Toledo	Model S20
参照细胞	世界精密仪器公司	RC1T
科学天平	Mettler Toledo	XS64
1000毫升容量瓶
水，无菌超纯，R>18.18 兆欧·厘米（例如，经 Millipore-Sigma 水纯化系统过滤）	Millipore-Sigma	CDUFBI001