急性脑切片中神经元连接的成对膜片钳记录

摘要

来源：Qi, G., 等. 利用配对膜片钳记录技术对急性脑片中神经元微环路进行电生理学与形态学表征. J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了通过固定脑切片、定位移液管以实现全细胞记录构型，并刺激突触前神经元来记录突触后反应，从而揭示神经元连接关系的突触连接图谱绘制方法。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 配对膜片钳记录与生物胞素填充

根据突触连接的类型，采用三种不同的方法来寻找突触耦合的神经元。如果连接概率较低（大多数兴奋性连接的情况），请按以下步骤进行：

1. 低连接性的神经元连接
   1. 使用 表1 所列成分的内液填充记录电极。在全细胞记录配置中，需在内液（电极液）中加入浓度为 3 - 5 mg/ml 的生物胞素，以获得良好的突触前和突触后神经元染色效果。让生物胞素在细胞内扩散至少 15 - 30 分钟（根据神经元大小而定）。
      ​注意：不要将生物胞素添加到下文所述“搜索”电极所使用的溶液中。
   2. 以全细胞模式对潜在的突触后神经元进行膜片钳记录。使用长而细的电极柄，这有助于在物镜下灵活操控电极，并减少电极插入脑片时可能产生的运动伪迹。
   3. 随后，使用电阻为 8 - 10 MΩ、尖端直径较小的“搜索”膜片电极，以细胞贴附式（cell-attached）配置对潜在的突触前神经元进行记录。这些电极形成一种“松散”的细胞贴附式封接。将“搜索”电极内填充一种用 Na⁺ 替代 K⁺ 的内液（表2），以防止在寻找突触前细胞过程中神经元发生去极化。
      注意：“松散”封接的电阻不在 GΩ 范围，通常约为 30 - 300 MΩ。
   4. 在电流钳模式下，将“松散”封接下的膜电位维持在约 -30 至 -60 mV。然后施加大电流脉冲（0.2 - 2 nA），以在潜在的突触前细胞中诱发动作电位。在电压反应中可观察到该动作电位表现为一个小的尖波。
   5. 将刺激频率设定为 0.1 Hz，以防止突触后反应衰减。若脑组织非常不成熟或突触连接可靠性较低，可使用更低的刺激频率。
   6. 若“突触后”神经元对所测试的“突触前”神经元刺激无反应，则换一个新的神经元建立“松散”封接。只要封接电阻保持在 >30 MΩ，就不必更换“搜索”膜片电极。通过此方法，最多可测试多达 30 个潜在的突触前神经元。
      注意：为防止在使用松散膜片钳进行搜索过程中损伤神经元，对搜索电极施加的负压应比全细胞记录电极更轻柔。
   7. 若在“松散”封接模式下的刺激在突触后神经元中引发潜伏期 <5 毫秒的 EPSP/IPSP（兴奋性突触后电位/抑制性突触后电位），则将“搜索”电极从突触前神经元上移开。
   8. 将“搜索”膜片电极更换为含有生物胞素的标准内液填充的记录电极。确保该记录电极的电阻为 4 - 8 MΩ；细胞体越大，电极电阻可适当降低。
   9. 对突触前神经元进行全细胞膜片钳记录，采用电流钳模式。通过电流注入在突触前神经元中诱发动作电位，并记录突触后反应。将数据存储于计算机中，供后续离线分析使用。

表1. 低氯化物移液管溶液。

	mM	g/L	g/50 ml
K-葡萄糖酸盐	135	31.622	1.5811
KCl	4	0.298	0.0149
HEPES	10	2.384	0.1192
磷酸肌酸	10	2.552	0.1276
ATP-Mg²⁺	4	2.028	0.1014
GTP-Na	0.3	0.156	0.0078
用 KOH 调节 pH 至 7.3
渗透压约为 300 mOsmol/L
加入 3 - 5 mg/ml 生物胞素

表2. 用于搜寻突触连接神经元的高钠电极内液。

	mM	g/L	g/50 ml
Na-gluconate	105	22.92	1.146
NaCl	30	1.76	0.088
HEPES	10	2.384	0.1192
Phosphocreatine	10	2.552	0.1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0.1014
GTP-Na	0.3	0.156	0.0078
用 NaOH 调节 pH 至 7.3
渗透压约为 300 mOsmol/L

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	HEKA	EPC 10 USB Triple	带 2-3 个前置放大器
显微镜	Olympus	BX51WI	配有 2 个相机接口、4× 物镜和 40× 水浸物镜
相机	TILL Photonics	VX55	红外 CCD 相机
工作站	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	带电动 x-y 载物台和显微镜的电动调焦轴
微操纵器	Luigs & Neumann	SM-5	用于 2-3 个前置放大器的 x-y-z 操纵器
法拉第笼	Luigs & Neumann
防震台	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
切片机	Microm International	HM650V
微电极拉制仪	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida 系统	Microbrightfield		配备 Neurolucida 和 Neuroexplorer 软件